痛风泰颗粒水提工艺的优化

王佛长， 黄诗莹， 陈剑平， 张尚斌， 谢静静， 张剑勇*

（1. 深圳市中医院， 深圳市医院中药制剂研究重点实验室， 广东 深圳518033； 2. 广州中医药大学第四临床医学院， 广东 深圳518033）

痛风泰是著名岭南温病学家刘仕倡先生献方,深圳市中医院张剑勇医生整理并结合临床经验调整而成, 为治疗痛风的有效方剂, 由山慈菇、 土茯苓、 粉萆薢、 秦艽、 赤芍、 川牛膝、 山茱萸7 味药材组成, 具有清热利湿、 解毒化浊、 祛瘀止痛等功效, 临床应用5 年以上, 疗效确切安全[1-6], 但其剂型为汤剂, 携带不便, 服用量大, 不能很好满足现代都市人需求, 故本实验拟将其进一步研制成颗粒剂以方便患者服用。 前期研究表明, 痛风泰中臣药土茯苓有效成分落新妇苷具有镇痛、 活血化瘀、抑制高尿酸血症等作用[7]； 佐药赤芍的指标性成分为芍药苷, 与其他中药配伍可治疗类风湿性关节炎, 有着抗炎、 抗凝、 抗血栓作用[8], 故本实验以这2 种成分含有量结合干膏得率为评价指标, 正交试验优化痛风泰颗粒水提工艺, 为该制剂放大生产提供可靠依据。

1 材料

1.1 仪器 LC-2030 高效液相色谱仪、 AUMA220D分析天平（日本岛津公司）； 超声波清洗仪（250 W、 40 kHz, 深圳市和科达超声设备有限公司）；500-2 恒温干燥箱（上海跃进医疗器械厂）； HHS 电热恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司）。

1.2 试药 落新妇苷（批号111798-201504, 含有量93.9%）、 芍药苷（批号wkq17102709, 含有量≥98%） 对照品分别购自中国食品药品检定研究院、四川省维克奇生物科技有限公司。 山慈菇（批号17100101）、 秦艽（批号17101901）、 赤芍（批号17061001） 均购自深圳市华辉药业有限公司, 土茯 苓 （ 批 号 20170801 ）、 粉 萆 薢 （ 批 号170709001）、 川牛膝（批号171101）、 山茱萸（批号180101） 分别购自深圳市合丹医药有限公司、康美药业股份有限公司、 广州至信中药饮片有限公司、 广东源森泰药业有限公司, 经深圳市中医院药检室专家鉴定为正品, 均符合2015 年版《中国药典》 一部要求。 甲醇、 乙腈为色谱纯（美国默克公司）； 其余试剂均为分析纯； 水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 优化参数确定 按处方比例称取方中山慈菇、土茯苓、 粉萆薢等7 味药材, 加水煎煮, 滤过, 放冷, 滤液浓缩并定容至500 mL。 采用正交试验,以浓缩液中落新妇苷、 芍药苷含有量及干膏得率为评价指标, 加水量（A）、 煎煮时间（B）、 煎煮次数（C） 为影响因素, 正交试验进行优化, 因素水平表1。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

2.2 干膏得率测定 精密量取“2.1” 项下浓缩液25 mL, 置已干燥至恒定质量的蒸发皿中, 水浴蒸干, 按照干燥失重测定法（2015 年版《中国药典》 四部通则0831） 测定, 计算干膏得率, 公式

2.3 落新妇苷、 芍药苷含有量测定

2.3.1 色谱条件 Hypersil ODS-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm）； 流动相乙腈 （A） -0.1%磷酸（B）, 梯度洗脱（1～18 min, 17% ～23%A； 18～25 min, 90%A； 25～30 min, 17%A）； 检测波长230 nm； 柱温30 ℃； 体积流量0.8 mL/min；进样量5 μL。

2.3.2 溶液制备

2.3.2.1 对照品溶液 精密称取落新妇苷、 芍药苷对照品适量, 甲醇分别制成含两者0.20、0.50 mg/mL的溶液, 即得。

2.3.2.2 供试品溶液 取“2.1” 项下浓缩液适量, 过0.45 μm 微孔滤膜, 取续滤液, 即得。

2.3.2.3 阴性样品溶液 按处方量分别称取不含土茯苓、 赤芍的阴性样品, 按“2.3.2.2” 项下方法制备, 即得。

2.3.3 专属性考察 取对照品、 供试品、 阴性样品溶液, 在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定, 结果见图1, 可知供试品溶液在与对照品溶液同一保留时间处有相同色谱峰, 阴性无干扰。

2.3.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液适量,甲醇逐级稀释成分别含落新妇苷0.050 6、 0.101、0.202、 0.405、 0.810、 1.62 mg/mL, 芍药苷0.054 4、0.109、 0.218、 0.435、 0.870、 1.74 mg/mL。 以溶液质量浓度为横坐标（X）, 峰面积为纵坐标（Y）进行回归, 得方程分别为落新妇苷Y=1.550 45×107X+425 997 （r=0.999 8）、 芍药苷Y=7.722 81×106X+232 333 （r= 0.999 9）, 分别在0.050 6 ～1.62、 0.054 4～1.74 mg/mL 范围内呈良好的线性关系。

2.3.5 检测限与定量限 按信噪比S/N=3, 落新妇苷、 芍药苷检测限分别为0.36、 0.45 μg/mL；按信噪比 S/N = 10, 两者定量限分别为1.16、 1.53 μg/mL。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.6 精密度试验 精密吸取对照品溶液适量,在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定6 次, 测得落新妇苷、 芍药苷峰面积RSD 分别为1.64%、0.43%, 表明仪器精密度良好。

2.3.7 稳定性试验 取供试品溶液适量, 于0、2、 4、 6、 12、 24 h 在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定, 测得落新妇苷、 芍药苷峰面积RSD 分别为0.30%、 0.55%, 表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.8 重复性试验 取同一供试品溶液6 份, 在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定, 测得落新妇苷、芍药苷峰面积RSD 分别为1.01%、 0.87%, 表明该方法重复性良好。

2.3.9 加样回收率试验 取落新妇苷（0.922 mg/mL）、 芍药苷（0.685 mg/mL） 含有量已知的浓缩液适量, 共9 份, 分别精密加入相当于各成分含有量50%、 100%、 150% 的对照品, 按“2.3.2.2” 项 下 方 法 制 备 供 试 品 溶 液, 在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定, 计算回收率。结果, 落新妇苷、 芍药苷平均加样回收率分别为96.15%、 95.32%, RSD 分别为0.68%、 1.43%。

2.4 综合权重系数计算 层次分析（AHP） 法是主观权重赋值, 而客观权重赋权（CRITIC） 法是客观权重赋值, 本实验采用AHP-CRITIC 混合加权法[9]。 根据中药复方君臣佐使规律及各成分药理作用强弱, 将落新妇苷、 芍药苷含有量及干膏得率作为权重指标予以量化, 即每个指标分成3 个层次, 并确定优先顺序为落新妇苷含有量＞芍药苷含有量＞干膏得率, 构建指标成对比较的判断优先矩阵[10], 结果见表2。然后, 通过AHP 分析软件进行具体计算, 测得落新妇苷含有量、 芍药苷含有量、 干膏得率权重系数分别为0.558 4、 0.319 6、 0.122 0。 一致性比例因子（CR） = CI/RI, 当CR＜0.1 时, 指标优先比较判断矩阵具有理想的一致性, 权重系数有效,本实验中CR 为0.017 6, 表明权重计算正确。 再将表2 数据经线性插值处理[指标成分值= （实测值-最小值） / （最大值-最小值） ×100], 消除单位量纲后计算各指标对比强度 （si）、 冲突性（δi）、 综合权重 （ci）、 权重 （ωi）[11-12], 结果见表3。

表2 指标成对比较的判断优先矩阵Tab.2 Judgement priority matrices for the pair comparison of indices

综合AHP 法和CRITIC 法, 根据公式ω （综）ij=ω （ AHP ）ij× ω （ CRITIC）ij/∑ω （ AHP ）ij×ω （CRITIC）ij, 得到落新妇苷含有量、 芍药苷含有量、 干膏得率综合权重分别为0.503 5、 0.400 9、0.095 6。

表3 相关计算数据Tab.3 Relevant calculation data

2.5 正交试验 按L9（34） 正交表设计试验, 加权评分法设定落新妇苷、 芍药苷含有量和干膏得率的加权系数分别为0.5、 0.4、 0.1, 综合评分=（落新妇苷含有量/最大值×0.5+芍药苷含有量/最大值×0.4+干膏得率/最大值×0.1） ×100。 结果见表4, 方差分析见表5。

表4 试验设计与结果Tab.4 Design and results of tests

表5 方差分析Tab.5 Analysis of variance

由表4 可知, 各因素影响程度依次为B＞C＞A；由表5 可知, 因素B 有显著影响（P＜0.05）, 而因素A、 C 无显著影响（P＞0.05）。 从生产实际、 节约成本角度考虑, 确定最优工艺为A1B3C1, 即加8倍量水提取3 次, 每次1 h。

2.6 验证试验 按处方比例称取药材, 以优化工艺进行3 批验证实验, 结果见表6, 可知工艺稳定可行。

3 讨论

3.1 提取工艺选择 痛风泰颗粒由7 味药材组成,以水溶性成分为主, 如秦艽主要含有环烯醚萜苷类[13], 山茱萸主要含有熊果酸、 马钱苷、 总多糖、有机酸等[14]。 考虑到各成分溶解性能和生产成本,本实验选择水煎煮提取。

表6 验证试验结果（n=3）Tab.6 Results of verification tests （n=3）

3.2 评价指标与权重选择 痛风泰颗粒中君药山慈菇有清热解毒、 消肿散结之功效, 其主要药效成分秋水仙碱对痛风有特效, 但不良反应及副作用大[15], 结合该药材在全方中所占比例及该成分在该药材中含有量, 未将其作为评价指标, 为本实验不足之处, 会在后续制剂标准研究中加以改进。 本实验以土茯苓中落新妇苷含有量, 赤芍中芍药苷含有量、 干膏得率为评价指标, 与2015 年版《中国药典》 药材标准中的相关指标成分一致, 有利于从原料到制剂的全面控制, 保证临床用药安全性和有效性。

权重系数确定的方法有专家打分法、 主成分分析法、 模糊综合评价法、 层次分析法、 CRITIC 法等[16-17], 其中前4 种方法主观性较强, 而CRITIC法能体现客观数据。 本实验首先采用AHP 法量化评价指标间比较判断的优先信息, 得到主观权重系数, 再采用CRITIC 法, 以评价指标间的对比强度及冲突性为基础, 得到客观权重系数, 该方法既注重客观性, 又不失主观性。

3.3 色谱条件优化 本实验首先选择甲醇-0.1%冰醋酸（39 ∶61） 流动相, 结果只能分离出落新妇苷； 再选择乙腈-0.1% 磷酸 （14 ∶ 86） 流动相[18-19], 发现能同时分离出芍药苷和落新妇苷。然后, 通过增加乙腈比例、 调整柱温和体积流量、更换色谱柱, 解决了落新妇苷峰形差、 出峰时间长等问题, 并提高了芍药苷分离度。 2015 年版《中国药典》 分别采用291、 230 nm 波长对落新妇苷、芍药苷进行检测, 本实验为了避免波长切换, 简化方法, 在结合相关文献的基础上考察230 nm 波长处落新妇苷出峰情况[20], 发现其色谱峰有良好的响应值, 方法确切可行, 故选择该波长同时检测落新妇苷和芍药苷。