一测多评法同时测定广藿香中4 种成分

2019-08-26李小琪范燕豪王婷婷侯剑伟尤丽莎

中成药 2019年8期

李小琪，范燕豪，陈阳，王婷婷，侯剑伟，尤丽莎

（上海中医药大学，上海201203）

广藿香Pogostemon cablin （Blanco） Benth. 是我国常用传统中药, 多用于治疗湿浊中阻、脘痞呕吐、暑湿倦怠、腹痛吐泻及头痛等[1]。其原产东南亚, 后传入中国, 最初作香料使用, 后来在岭南一带普遍种植, 目前在高要、肇庆、阳江、湛江和海南等地区均有栽培[2]。

广藿香的化学成分主要集中在挥发油, 含有百秋李醇、广藿香酮、广藿香烯、 β-榄香烯、愈创木烯、石竹烯等[3-9]。《中国药典》对广藿香药材及广藿香油中百秋李醇的含有量进行了规定。研究表明[10-12], 广藿香中广藿香酮和石竹烯等也是其抗真菌、抗病毒的主要成分。因此, 本实验建立一测多评法[13-16]同时测定广藿香中β-榄香烯、 β-石竹烯、百秋李醇、广藿香酮的含有量, 以期为全面控制广藿香药材的质量奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 6890 N、 Agilent 7890B 气相色谱仪（美国安捷伦公司）； Agilent DB-1、 Agilent DB-5、 Agilent HP-5 毛细管柱（30 m×0.25 mm,0.25 μm, 美国安捷伦公司）； ME204/02 电子分析天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；SB-5200D-250 超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）； SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；粉碎机（上海广沙工贸有限公司）。

1.2 试药 β-榄香烯（批号100268-200401）购自中国食品药品检定研究院； β-石竹烯（批号S09J9I51386）、百秋李醇（批号Z16A9X58775）、广藿香酮（批号P11A8F33626）均购自上海源叶生物科技有限公司；正十八烷（批号20160627）、二氯甲烷（批号20170823）和色谱纯正己烷（批号18010072）均购自国药集团化学试剂有限公司。

收集了21 批不同产地的广藿香药材, 记为S1～S21。其中S1、 S8、 S16 ～S18 产地为广东肇庆高要禄步； S2～S3、 S10～S13 产地为广东肇庆高要河台； S7、 S14 ～S15 产地为广东肇庆德庆武垄；S4～S6、 S9 产地为广东肇庆高要乐城； S19 产地为广东阳江阳春潭水； S20 产地为广东茂名高州；S21 产地为海南万宁。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent HP-5 弹性石英毛细管柱（30 m×0.32 mm, 0.25 μm）；进样口温度250 ℃；检测器温度280 ℃； 20 ∶1 分流进样；初始温度100 ℃, 保持1 min, 5 ℃/min 的速率升温至140 ℃, 保持5 min, 3 ℃/min 的速率升温至190 ℃, 10 ℃/min 的速率升温至230 ℃, 保持2 min；体积流量0.7 mL/min。色谱图见图1。

图1 各成分气相色谱图Fig.1 Gas chromatograms of various constituents

2.2 对照品溶液制备分别精密称取β-榄香烯、β-石竹烯、百秋李醇、广藿香酮对照品适量, 正己烷溶解, 制成对照品贮备液, 质量浓度分别为2.709、 3.360、 19.26、 14.27 mg/mL。

2.3 内标溶液制备精密称取适量正十八烷, 用正己烷溶解制成内标溶液（质量浓度15.020 mg/mL）。

2.4 混合对照品溶液制备各精密量取β-榄香烯、 β-石竹烯、百秋李醇、广藿香酮贮备液2.5 mL, 混匀, 定容至10 mL 量瓶, 即得。

2.5 供试品溶液制备精密称定广藿香药材粗粉3.0 g, 加50 mL 二氯甲烷, 超声处理（每次20 min, 共3 次）, 过滤, 合并滤液, 回收溶剂至干, 正己烷溶解残渣, 转移至5 mL 量瓶, 精密加入0.5 mL 内标溶液, 加正己烷定容, 用0.45 μm微孔滤膜过滤, 即得。

2.6 方法学考察

2.6.1 线性关系考察分别精密量取混合对照品溶液3.50、 2.50、 1.50、 1.00、 0.50、 0.20 mL 于5 mL 量瓶, 加入内标溶液0.5 mL, 用正己烷定容得到系列质量浓度混合对照品溶液。各精密吸取1 μL, 在“2.1” 项条件下进样, 以对照品溶液质量浓度为横坐标（X）, 对照品与内标峰面积之比为纵坐标（Y）进行回归, 结果见表1。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.6.2 日内精密度试验分别取高、中、低浓度的混合对照品溶液, 在 “2.1” 项条件下进样6次, 并与内标峰面积比较。测得β-榄香烯、 β-石竹烯、百秋李醇、广藿香酮精密度RSD 分别为0.56%、 0.58%、 0.47%、 0.53%, 表明仪器日内精密度良好。

2.6.3 日间精密度试验分别取高、中、低浓度的混合对照品溶液, 连续3 d, 在“2.1” 项条件下进样3 次, 并与内标物的峰面积作比较。测得β-榄香烯、 β-石竹烯、百秋李醇、广藿香酮的精密度RSD 分别为0.52%、 0.55%、 0.49%、 0.46%,表明仪器日间精密度良好。

2.6.4 重复性试验精密称定3.0 g 广藿香药材粗粉（S2）, 按“2.5” 项下方法制备供试品溶液6 份, 在“2.1” 项条件下进样, 测得β-榄香烯、 β-石竹烯、百秋李醇、广藿香酮平均含有量RSD 分别为1.00%、 1.56%、 0.76%、 0.83%, 表明该方法重复性良好。

2.6.5 稳定性试验取同一供试品溶液（S2）,室温放置, 在“2.1” 项条件下, 于0、 2、 4、 8、12、 24 h、进样1 μL, 并与内标物的峰面积比较。测得β-榄香烯、 β-石竹烯、百秋李醇、广藿香酮峰面积比值RSD 分别为0.14%、 0.27%、 0.27%、0.39%。表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.6.6 加样回收率试验精密称取S2 样品广藿香药材粗粉6 份, 每份1.5 g, 精密称定, 每份样品分别加入相应对照品（百秋李醇10 mg、广藿香酮4.5 mg； 0.378 mg/mLβ-榄香烯1 mL； 1.025 mg/mL β-石竹烯1 mL）, 按“2.5” 项下方法制备供试品溶液6 份, 测得4 种成分的加样回收率结果见表2。

表2 各成分加样回收率试验结果（n=6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents （n=6）

2.7 相对校正因子计算按照相对校正因子计算公式, 以百秋李醇为内参物, 精密吸取1 μL 系列不同质量浓度混合对照品溶液, 在“2.1” 项条件下进样, 记录对照品与内标峰面积, 计算其余3 种成分的相对校正因子。结果见表3。

表3 各成分相对校正因子Tab.3 Relative correction factors of various constituents

2.8 重复性考察取混合对照品溶液1 μL, 在“2.1” 项条件下进样, 考察Agilent 6890 N 和Agilent 7890B 气相色谱系统, 以及Agilent DB-5、Agilent DB-1 （30 m × 0.25 mm, 0.25 μm）和Agilent HP-5 （30 m×0.32 mm, 0.25 μm） 3 种色谱柱对广藿香各成分相对校正因子的影响, 结果表明, 不同仪器及色谱柱对广藿香各成分相对校正因子均无显著影响, 见表4。

表4 不同仪器和色谱柱上相对校正因子Tab.4 Relative correction factors on different instruments and columns

2.9 色谱峰定位取“2.5” 项下的混合对照品溶液, 采用不同的色谱柱, 在不同的气相色谱系统上, 测定并计算待测成分β-榄香烯、 β-石竹烯、广藿香酮与内参物百秋李醇间的保留时间差和相对保留值。结果显示保留时间差法波动较大, 用于广藿香中待测成分的一测多评定位不合适。而不同色谱柱和不同系统下, 各待测成分的相对保留值波动较小, RSD≤1.93%, 重现性更好, 更适宜于一测多评中对广藿香中待测成分进行色谱峰定位, 见表5～6。

表5 不同仪器和色谱柱上不同气相色谱系统测得的相对保留值Tab.5 Relative retention values on different instruments and columns

表6 不同仪器和色谱柱上保留时间差Tab.6 Differences in retention time on different instruments and columns

2.10 样品含有量测定取21 批不同产地样品,按“2.5” 项下方法制备供试品溶液, 在“2.1”项条件下进样, 采用一测多评法对广藿香中β-榄香烯、 β-石竹烯、百秋李醇、广藿香酮进行含有量测定及计算。同时采用t 检验法对内标法含有量测定值与一测多评法的测定结果进行比较, 见表7。结果表明, 2 种方法得到的β-榄香烯、 β-石竹烯、广藿香酮含有量的P 值分别为0.85、 1.00、 0.95,差异不显著性（P＞0.05）。因此内标法和一测多评法测得的广藿香中β-榄香烯、 β-石竹烯、百秋李醇、广藿香酮含有量无显著性差异。