桔小实蝇雌成虫对寄主挥发物β-石竹烯的行为反应

高 扬，李慧静，陆永跃，程代凤*

(华南农业大学植物保护学院，广州 510642)

桔小实蝇Bactroceradorsalis是一种可对农业生产造成严重危害的害虫，其经济寄主超过 150多种水果和蔬菜(Chenetal., 2008; Schutzeetal., 2017)。目前，桔小实蝇已在热带和亚热带的大部分地区广泛分布，并且被许多国家和地区列为检疫性有害生物。已有研究表明，植物源挥发物可有效引诱或驱避桔小实蝇，某些挥发物已被用于桔小实蝇监测。例如，植物源的甲基丁香酚可强烈地引诱桔小实蝇的雄虫(Tanetal., 2014)，接触过甲基丁香酚的雄虫会获得交配竞争优势(Shelly 2000; Vargasetal., 2010; Tan and Nishida 2012; Tanetal., 2014)。另外，甲基丁香酚还可以驱避桔小实蝇的寄生蜂(Guetal., 2018)。香茅草中的香茅醛可显著驱避桔小实蝇产卵(Yietal., 2014)，芒果中的γ-辛内酯、惕各酸乙酯、苯并噻唑和蘑菇醇则可影响桔小实蝇对产卵场所的选择(Kamala Jayanthietal., 2014; Pagadala Damodarametal., 2014; Pagadala Damodarametal., 2015)。

β-石竹烯(beta-caryophyllene)是一种许多植物都能合成的挥发物，研究发现该物质对昆虫具有双重效果。例如β-石竹烯对赤拟谷盗Triboliumcastaneum和嗜卷书虱Liposcelisbostrychophila(Wangetal., 2019)具有非常显著的驱避作用，对中华蜜蜂Apiscerana(Annammaetal., 2018)、烟青虫Helicoverpaassulta(Sunetal., 2012)和斜纹夜蛾Spodopteralitura(Fangetal., 2018)则有显著的引诱作用。中华蜜蜂在觅食过程中会显著偏好于可产生β-石竹烯的Jacquemontiapentanthos(Annammaetal., 2018)。另外，研究还发现β-石竹烯对库蚊Culextritaeniorhynchus、按蚊Anophelessubpictus和伊蚊Aedesalbopictus有非常高的毒性(Govindarajanetal., 2016)。植物中β-石竹烯还可被植食性昆虫取食诱导并选择性地引诱植食性昆虫的寄生天敌(Kollneretal., 2008)。

已有相关文献报道β-石竹烯对实蝇类昆虫行为的影响。例如，在缺少β-石竹烯的情况下白浆果对绕实蝇Rhagoletiszephyria的吸引力会显著下降(Chaetal., 2017)。β-石竹烯和α-蛇麻烯的混合物会强烈的引诱番石榴实蝇(Jaleeletal., 2019)。芒果中的β-石竹烯则可以引起地中海实蝇显著的触角电位反应，而且对雌虫的反应要显著强于雄虫(Cosséetal., 1995)。然而，关于β-石竹烯对桔小实蝇产卵行为的影响尚未见报道。本文对桔小实蝇3种寄主水果挥发物进行了鉴定，测试了共有物质β-石竹烯对桔小实蝇的引诱作用，为开发该虫植物源诱集提供了依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1供试昆虫

桔小实蝇于2016年5-6月采集于广东省广州市杨桃公园，在室内温度25±1℃、相对湿度70%～80%、光周期16 L ∶8 D的养虫室内饲养。实验室桔小实蝇使用人工饲料饲养(Chengetal., 2017)。

1.1.2供试材料及药品配制

β-石竹烯精油(95%，东京化成工业株式会社，CAS:87-44-5)500 mL密度0.9 g/cm3。分别用无水乙醇稀释至0.9、9、90和900 μg/mL的溶液，冰箱低温(-18℃)保存备用。

1.2 研究方法

1.2.1产卵选择实验

取30头处于产卵期的桔小实蝇雌虫置于一个长宽高均为40 cm的笼子中，在笼子中放置特制的产卵诱集盒(一个高和直径均为3 cm的圆柱形食料盒，盒盖上钻有3排12个小孔供实蝇产卵)对实蝇卵进行收集。分别在市场购买番石榴、橙子和芒果，将3种水果分别用榨汁机匀浆成果泥。分别在产卵诱集盒中加入2 g果泥放入实蝇笼子中进行产卵诱集，3 h后取出诱集盒并计算诱集盒中实蝇卵的数量。

在测试β-石竹烯对桔小实蝇产卵的影响时，取 4个产卵诱集盒放置于笼子中，在诱集盒中分别加入2 g番石榴果泥，其中3个诱集盒中的果泥分别混入9、90和900 μg β-石竹烯(体积为1 mL)，另一个加入同样体积的无水乙醇作为空白对照。对桔小实蝇产卵诱集3 h后取出诱集盒并计算每个诱集盒中实蝇卵的数量。

1.2.2果实中挥发物的鉴定

用气相质谱(GC-MS)(安捷伦科技有限公司，GC:7890B, MS:5977B)分析方法对番石榴、橙子和芒果中挥发物进行鉴定。具体操作方法：将2 g果泥添加到一个20 mL的棕色瓶中，然后用100-μm聚二甲基硅氧烷固相微萃取萃取头(PMDS)对果泥中挥发物进行萃取，萃取时间为40 min，萃取温度为水浴37℃。萃取结束后将萃取头插入气相质谱仪的进样口，在250℃下热解析3 min后进行气相质谱分析。气相质谱条件，柱子：HP-5 MS (30 m, 0.25 mm内径, 0.25 μm厚度)；载气：110.9 kPa氦气；柱箱温度50℃保持2 min，以5℃/min升至140℃，其后以10℃/min升至250℃，保持10 min。β-石竹烯根据NIST普库中的特征离子片段进行鉴定，同时购买β-石竹烯的标准品对鉴定到的β-石竹烯进行再次确认。为了测定果泥中β-石竹烯的绝对含量，取β-石竹烯的标准品用无水乙醇稀释至250，25，2.5，0.25，0.025，0.0025 μg/μL 6个浓度梯度，取2 mL不同浓度梯度的β-石竹烯用PMDS萃取头在水浴37℃萃取40 min后在气相质谱仪中进样检测，对β-石竹烯的峰面积和浓度绘制标准曲线。根据样品中β-石竹烯的峰面积可用标准曲线计算β-石竹烯的浓度。

1.2.3桔小实蝇雌虫触角电位(GC-EAD)测试

用GC-EAD方法测试桔小实蝇雌虫触角对β-石竹烯的反应。气相色谱(7890B)条件，柱子：HP-5 (30 m, 0.25 mm内径, 0.25 μm厚度)；载气：110.9 kPa氦气；柱箱温度：40℃保留2 min，10℃/min升至250℃，保留5 min。将桔小实蝇雌虫头部沿中间切下，将其中一个触角末端切开，然后连接到触角电位仪的两个玻璃电极上，其中参考电极连接头部，记录电极连接触角端部。在气相色谱仪进样口进1 μL β-石竹烯 (10 μg/mL，测试桔小实蝇的触角电位反应，实验中测试3对以上雌虫触角对β-石竹烯的反应。

1.2.4桔小实蝇对β-石竹烯的嗅觉反应测试

应用一个Y型嗅觉仪测试单头桔小实蝇雌虫对β-石竹烯的行为反应。在实验中，分别测试雌虫对900、90、9和0.9 μg/mL β-石竹烯(溶于无水乙醇当中)的反应。实验过程中，在Y型嗅觉仪的一个味源瓶中加入1 mL β-石竹烯溶液，另一个味源瓶中加入1 mL无水乙醇作为对照。实验过程中保持气流流速为1.3 L/min。雌虫放入Y型管中观察5 min，当雌虫进入Y型管一侧超过3 cm且停留时间超过1 min则记为1个有效选择。实验过程中只统计有效选择的虫数。在进行10个有效重复后，将装置拆解开用酒精进行冲洗并烘干，然后再进行重复实验，每组实验记录60个有效重复。

应用一个四臂嗅觉仪(中央昆虫活动室：55 cm长，3 cm深)测试桔小实蝇雌虫群体对β-石竹烯的反应。在四臂嗅觉仪四个臂的味源瓶中分别加入1 mL无水乙醇，0.9、9和90 μg/mL β-石竹烯溶液，在4个臂中持续通入1.3 L/min的气流，各项条件准备好后在昆虫活动室中放入100头处于产卵期的桔小实蝇雌虫。实验中将整个装置用不透光的黑布罩住，防止光源对实蝇的选择造成影响。实验4次重复。

1.3 数据分析

用卡方检验(P<0.05)分析Y型嗅觉仪中处理与对照间差异，单因素方差分析比较不同果中产卵量及石竹烯含量的差异，Kendall非参数检验比较分析四臂嗅觉仪中雌虫对β-石竹烯各浓度的选择及产卵差异，以上分析均使用SPSS 17。

2 结果与分析

2.1 供试水果果泥对桔小实蝇产卵的引诱作用

3种水果的果泥均可引诱处于产卵期的桔小实蝇雌虫产卵，3 h内每种果泥均能诱集到超过200粒卵，且3种水果诱集到卵的数量无显著差异(F2, 26=3.189，P=0.0577; 图1)。这表明所选水果果泥中均可能存在引诱桔小实蝇雌虫产卵的挥发物。

2.2 果泥中β-石竹烯含量及雌虫对其触角电位反应

应用GC-MS分析中发现，番石榴、橙子和芒果中均含有β-石竹烯(图2)，而且3种水果中β-石竹烯的含量没有显著差异(F2, 15=3.049，P=0.0774; 图3)。另外，10 μg/mL的β-石竹烯能够引起所有测试雌虫的触角电位反应(图4)。

图1 不同水果上桔小实蝇的产卵量Fig.1 Egg of the fruit fly on the different fruits注：图中黑点数表示重复次数，相同字母表示数据示邓肯氏多重比较在0.05水平上差异不显著。Note: Number of black dots means the biological replicates. Same letters indicated figure was not different by Duncan’s test at 0.05 level.

图2 果实中β-石竹烯的GC-MS鉴定Fig.2 Identification of β-caryophyllene by GC-MS

图3 3种水果中β-石竹烯的含量Fig.3 β-caryophyllene content in fruits注：A，β-石竹烯定量的标准曲线；B，β-石竹烯在果实中的含量。图中黑点数表示重复次数，相同字母表示数据示邓肯氏多重比较在0.05水平上差异不显著。Note: A, Standard curve of β-caryophyllene quantification; B, Content of β-caryophyllene in different fruits. Number of black dots means the biological replicates. Same letters indicated figure was not different by Duncan’s test at 0.05 level.

图4 桔小实蝇雌虫对β-石竹烯的触角电位反应Fig.4 Electroantennogram response of β-caryophyllene to female antenae

2.3 β-石竹烯对桔小实蝇雌虫的引诱作用

Y型嗅觉仪实验结果表明，9 μg/mL的β-石竹烯可显著引诱桔小实蝇，而0.9、90和900 μg/mL的β-石竹烯对桔小实蝇雌虫均无显著诱集作用(图5)；四臂嗅觉仪实验也表明桔小实蝇雌虫会显著趋向于9 μg/mL的β-石竹烯，当β-石竹烯浓度高于9 μg/mL时，β-石竹烯浓度越高对实蝇的诱集效果就越差(Kendall W=0.728, df=3,P=0.012, 图6)。另外，产卵诱集实验则进一步表明果泥中β-石竹烯含量在10.09 μg/g(自然情况下果中β-石竹烯的浓度)左右时可显著诱集桔小实蝇产卵，且当果中β-石竹烯浓度高于自然情况下的浓度时，β-石竹烯浓度越高诱集实蝇产卵的数量就越少(Kendall W=0.396, df=3,P=0.008, 图7)。

图5 雌虫在Y型嗅觉仪中对不同浓度β-石竹烯的选择Fig.5 Selection of females to different concentration of β-caryophyllene注：NS，差异不显著；***, P < 0.01。Note: NS, no difference；***, P < 0.01.

图6 雌虫在四臂嗅觉仪中对不同浓度β-石竹烯的选择Fig.6 Selection of females to different concentration of β-caryophyllene注：图中黑点数表示重复次数，不同字母表示数据经Kendall非参数检验在0.05水平上差异显著。Note: Number of black dots means the biological replicates. Different letters indicated figure significantly different by Kendall nonparametric test at 0.05 level.

图7 番石榴中不同含量β-石竹烯对产卵量的影响Fig.7 Effect of β-caryophyllene concentration in guava on oviposition注：图中黑点数表示重复次数，番石榴果β-石竹烯原始浓度为10.7 μg/g，图中不同字母表示数据经Kendall非参数检验在0.05水平上差异显著。Note: Number of black dots means the biological replicates. β-caryophyllene concentration in guava is 10.7 μg/g. Different letters indicated figure significantly different by Kendall nonparametric test at 0.05 level.

3 结论与讨论

本研究发现番石榴、橙子和芒果3种水果的果泥对桔小实蝇雌虫产卵均具有较好的引诱作用，通过对3种水果果泥中的挥发物进行鉴定和功能研究发现β-石竹烯是3种果泥中共有的挥发物；β-石竹烯对桔小实蝇雌虫产卵具有显著的引诱作用，但这种引诱作用取决于β-石竹烯的浓度，当果泥中β-石竹烯浓度为9 μg/g时对雌虫产卵的诱集效果最好，而当β-石竹烯浓度高于9 μg/g时诱集效果则会下降，甚至会驱避实蝇产卵。本研究首次报道了β-石竹烯浓度与桔小实蝇产卵诱集效果之间的关系，对进一步认识桔小实蝇雌虫对寄主进行产卵选择的行为具有重要意义。

研究结果表明，低浓度的β-石竹烯对桔小实蝇产卵具有引诱效果，而高浓度下引诱效果会减弱甚至产生驱避效果。这说明桔小实蝇对β-石竹烯的嗅觉反应受不同剂量β-石竹烯的影响。这种现象在其他双翅目昆虫中同样存在。刘燕等(2018)发现β-石竹烯在低剂量下，对斑翅果蝇Drosophilasuzukii雌成虫产卵行为表现为引诱效果，而高剂量下对其表现为产卵驱避效果，且随剂量升高，单雌累积产卵量呈下降趋势。另外，在模式生物果蝇中也存在这种现象。例如，低浓度的醋酸会显著引诱果蝇，而高浓度的醋酸对果蝇的吸引作用则会显著下降(Semmelhack & Wang, 2009)；果蝇对一些盐的趋性也存在类似的剂量效应，低盐食物可显著引诱，而高盐食物则会驱避果蝇(Zhangetal., 2013)。通过对相关分子机制进行研究发现，果蝇对不同浓度的醋酸表现出的趋向或驱避反应是通过激活不同的嗅神经小球来介导的，低浓度的醋酸可激活DM1和VA2两个嗅神经小球进而引起果蝇的趋向反应，而高浓度的醋酸则会激活另外的嗅神经小球从而引起驱避反应(Semmelhack & Wang, 2009)。果蝇对不同浓度盐分的识别是通过不同的味觉神经元介导的，一种名为IR76b的促离子型谷氨酸受体是用于识别低浓度的盐分的，而高浓度的盐分则是通过另外的受体识别的(Zhangetal., 2013)。桔小实蝇对不同浓度的β-石竹烯表现出的不同反应是否也是由类似机制介导则还需进一步证实。

近些年有许多研究人员对桔小实蝇的寄主选择行为进行了研究。金菊等(2015)发现不同品种的莲雾果实对桔小实蝇的引诱效果存在显著差异，同时他们也指出莲雾中的β-石竹烯对雌虫具有明显的引诱作用；施伟等(2009)选取马切苏芒和三年芒的完全成熟和未成熟果实对桔小实蝇进行趋性测试，结果表明桔小实蝇对2种完全成熟芒果的趋性更加明显，同时β-石竹烯均可在测试芒果中鉴定出来；王泽槐等(2010)在网室中测试了番石榴完全成熟果和腐烂果对桔小实蝇性成熟雌虫的引诱作用，结果发现腐烂果对桔小实蝇的诱集作用要显著高于完全成熟果，而β-石竹烯也可在2种番石榴中鉴定出来。然而，上述研究人员均未指出桔小实蝇寄主选择的偏好是否与β-石竹烯浓度存在相关性。事实上我们进一步分析他们的挥发物鉴定数据发现，上述研究中桔小实蝇嗜好寄主中β-石竹烯的含量均要低于桔小实蝇非嗜好的寄主。施伟等(2009)发现完全成熟芒果对桔小实蝇的引诱作用要大于未成熟芒果，而β-石竹烯在未成熟果的含量要远高于成熟果[三年绿硬芒(含量：1.67)VS三年黄软芒(含量：0.93)；马切苏绿硬芒(含量：3.31)VS马切苏黄软芒(含量：0.50)]；另外，王泽槐等(2010)发现β-石竹烯在番石榴完全成熟果中的含量也要远高于腐烂果[完全成熟果(含量：12.21)VS腐烂果(含量：1.44)]。结合我们的研究结果，我们认为桔小实蝇对不同品种，成熟度和腐烂与否寄主的选择偏好可能跟这些不同寄主中β-石竹烯浓度的不同具有相关性。

在害虫防治的方法中有一种通过控制害虫行为的推拉策略，即在作物田内，利用行为调控物质驱离害虫；在作物田外或田边，则利用引诱物质吸引害虫，并将害虫集中消灭(Cooketal., 2007)。桔小实蝇对不同浓度β-石竹烯表现出的不同反应则为田间桔小实蝇的防治提供了一种新的思路，可在实蝇寄主所在地放置一些高浓度β-石竹烯释放装置从而提高寄主周边β-石竹烯的浓度，但在稍远离寄主的位置则可放置β-石竹烯浓度(例如，9 μg/mL)刚好合适的诱集装置，从而形成一个对桔小实蝇的推拉系统来诱集桔小实蝇雌成虫，但该策略是否可行还需要进一步进行田间实验验证并优化。