广西‘金都一号’火龙果组培技术①

李清香 吴红英

(钦州市林业科学研究所 广西钦州535099)

火龙果（Hylocereus undatus），植物学名是量天尺 ［Hylocereus undatus（Haw.） Britt.et Rose］，是仙人掌科（Seleniereus）量天尺属［Hylocereus（Berg.） Britt.et Rose］ 多年生攀援肉质灌木，又名红龙果、青龙果、仙蜜果、玉龙果，原产中美洲至南美洲北部，世界各地广泛栽培［1］。火龙果因其外表肉质鳞片似蛟龙外鳞而得名，具有丰富的营养价值，是一种低热量、高纤维的水果［2-3］，符合现代人对营养、健康的需求，是近年来受消费者和种植户广泛关注的一种新兴热带亚热带果树。广西‘金都一号’火龙果（桂审果2016007号）是广西南宁金之都农业发展有限公司从中南美洲火龙果原种与红肉种的杂交后代中选育而成。该品种属于红皮红肉，自花授粉，不易裂果，果实甜度高，在广西、广东和海南广泛种植，是市场热销品种之一。由于种植面积逐年扩大，对火龙果苗木的需求也不断增加。采用种子繁殖，繁殖后代易变异，无法保持品种的优良特性。采用无性繁殖，可以保持品种的优良特性，目前火龙果育苗方式就是以扦插或嫁接为主的无性繁殖。但是传统的扦插育苗和嫁接育苗，繁殖数量完全不够市场的需求，而植物组织培养方式却可以在短时间内繁育大量品质保持一致的苗木，因此研究火龙果组培育苗技术显得尤为重要。中国火龙果组培技术研究起步比较晚，2000年以后才开始有零星报道［4-15］，火龙果组培技术开发的成功试验中，大多数研究以火龙果茎段为材料，开展外植体消毒、无菌芽诱导、继代增殖和生根诱导试验，筛选最佳培养方式方法，建立火龙果组培技术体系。随着火龙果品质的不断提升，近五年来火龙果开始到得到大众青睐，商业栽培的优质品种，如‘金都一号’、‘桂红龙’、‘大红’等，经济效益高、品质稳定，种植面积逐年增加。由于‘金都一号’是新选育出来的且已通过区域审定的品种，市场需求量大，通过组培快繁技术可以有效提供品质一致的苗木。通过查阅文献可知，近年来有关‘金都一号’组培技术的研究报道很少，仅有洪青梅等［16］有针对性地对该品种进行外植体诱导的研究，而未有其系统的研究成果，无法建立‘金都一号’组培技术体系。因此，很有必要在前人的研究基础上开展‘金都一号’组培技术的研究，初步建立一套‘金都一号’组培技术体系，为后续的研究提供重要参考资料，从而为新品种的推广提供优质苗木。

1 材料与方法

1.1 试验材料

广西钦州市林业科学研究所于2016年引种‘金都一号’，为了保证母株的安全，杜绝外界病毒的感染，引进的‘金都一号’种植于大棚内。本研究的所需材料均出自其新萌芽的茎段，将新萌芽的茎段剪下来带回实验室，先用清水冲洗，同时用毛刷轻轻刷洗刺座位置，将外植体表面的泥沙冲洗干净，然后沥干水份，装入干净的杯子备用。

1.2 方法

1.2.1 外植体消毒试验

本试验选择75%酒精和0.1%升汞2种常规的消毒剂，采用2种消毒方式（0.1%升汞、75%酒精＋0.1%升汞），其中升汞消毒时间分别为5、10、15min，75%酒精消毒时间为20 s。

将处理好的外植体放到超净工作台上，按设计方案依次操作，最后用无菌水清洗3～4次，每次冲洗1～2 min，沥干表面水分；切掉外植体切口坏死的部分肉茎，然后把外植体切割成每段带有2～3个刺座的茎段，垂直插入预培养基中，每个处理接种20瓶，重复3次，每瓶接种1个茎段；接种后7 d检查污染情况，统计污染数。

1.2.2 无菌芽诱导试验

以MS为基础培养基，附加不同浓度的植物生长调节剂 6-BA （1、5、8、11） mg/L、NAA （1、0.1） mg/L，对外植体进行诱导试验，观察不同配方对外植体诱导无菌芽的效果。将经过预培养后未污染、外植体颜色未变、切口愈伤组织正常的茎段进行切割，切割时以茎段棱柱的中心点为切割点，把棱柱纵向切割成3个棱边，然后再横向切割成带1个刺座的组织块，转入无菌芽诱导培养基，注意刺座不要插入培养基中，以免影响萌芽；每个处理接种30瓶，重复3次，每瓶接种1个组织块；接种后40 d观察无菌芽萌发情况，统计无菌芽诱导成功数。

1.2.3 增殖培养试验

以MS为基础培养基，以不同倍量大量元素（1/2、1、3/2）、不同浓度的植物生长调节剂6-BA（0.5、1、2） mg/L、NAA （0、0.1、0.2） mg/L组合的配方，设计3个因素各3个水平的正交试验，选择L9（34）正交表，共计9个处理，对无菌芽进行增殖培养试验，每个配方配制30瓶培养基；将无菌芽接种到增殖培养基，共9个处理，每个处理接种10瓶，重复3次，每瓶培养基接种一个完整芽；接种45 d后将新萌发的芽条切割成长度一致的茎段，转入新鲜培养基（培养基配方不变）培养，培养周期均为45 d，连续培养3代（周期），抽检记录增殖数量及生长情况，统计继代增殖系数。

1.2.4 生根培养试验

以MS为基础培养基，以不同倍量大量元素（1/2、1）、不同浓度的生根剂 ABT6（0、0.5、1）mg/L、 IBA （0、 0.5、 1） mg/L、 NAA （0、 0.1、0.2）mg/L组合的配方，设计2水平1因素和3水平3因素的正交试验，选择L18（2×37）正交表，对火龙果不定芽进行生根诱导试验，共计18个处理。

将增殖培养得到的丛生芽的顶芽进行切割，每段长度约2 cm，垂直插入生根诱导培养基，共18个处理，每个处理接种10瓶，重复3次，每瓶接种6个顶芽；接种后30 d统计每瓶生根株数、每株生根数、平均根长及株高。

1.2.5 培养条件

预培养基为无激素的MS培养基，预培养基、无菌芽诱导培养基及增殖培养基均加入蔗糖30 g/L、琼脂（强度为1 200）3.0 g/L，除增殖培养基需要指定pH值外，其余配方pH均为5.8；生根培养基加入蔗糖15 g/L、琼脂3.2 g/L、pH 6.0。按常规要求将各个培养基进行配制、高压灭菌、静置冷却备用。培养室温度26～28℃，每天光照13～14 h，光照强度2 000～5 000 lx。

1.2.6 数据处理

使用Excel2007和SPSS17.0数据处理系统进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同消毒方式及消毒时间对外植体消毒效果的影响

采用不同消毒方式与消毒时间对火龙果外植体进行消毒试验，其结果见表1。消毒效果最好的是处理5，污染率为55.70%；其次是处理6，污染率为57.23%；最差的是处理1，污染率为91.83%。

通过对以上结果进行单变量双因素方差分析（表2）可知，双因素均达到显著差异，即不同消毒方式与消毒时间对外植体污染影响达到显著水平。2种消毒方式的消毒效果达到显著差异，最好的消毒方式是复合消毒（即75%酒精＋0.1%升汞）。3个水平消毒时间的消毒效果也达到显著差异，其中消毒时间为5 min的消毒效果与10和15 min消毒效果达到显著性差异，而消毒时间为10和15 min的消毒效果没有显著性差异，因此合适的消毒时间为10和15 min。

表1 广西‘金都一号’火龙果外植体消毒试验结果

表2 不同消毒组合及消毒时间对外植体污染率的影响结果

综上，火龙果外植体消毒最佳方式为处理5和处理6，即先用75%酒精消毒20 s后，再用0.1%升汞消毒10～15 min。

2.2 不同培养基诱导无菌芽效果

以MS为基础培养基，附加4个浓度6-BA与2个浓度NAA，共计8种培养基（即8种处理），试验结果见表3。诱导率最高的是6号培养基，为85.56%；其次是5号培养基，为83.33%；最差的是1号和3号培养基，仅为2.22%和3.33%。

通过对以上数据进行单因变量双因素方差分析（表4）可知，不同浓度的6-BA对无菌芽诱导结果影响达到显著性差异，6-BA对诱导率影响很大，其中6-BA浓度为8.0 mg/L的培养基诱导效果最好，浓度为1.0 mg/L的培养基诱导效果最差。不同浓度的NAA对无菌芽诱导结果的影响未达到显著性差异，即NAA对诱导率影响不大。

综上，火龙果外植体诱导最适合的培养基为：MS附加6-BA 8.0 mg/L和NAA 0.1 mg/L（即6号培养基），诱导的无菌芽如图1所示。

表3 广西‘金都一号’火龙果无菌芽诱导试验结果

2.3 不同培养基增殖效果

不同培养基增殖效果如表5所示。经分析可知：平均增殖系数最高的是6号培养基，为7.13；其次是处理9，为6.67；最差的是1号培养基，仅4.07。对试验数据进行极差分析可知，对增殖系数影响的主次关系为A＞B＞C，初步筛选最优组合为A2B3C1（即6号培养基）。为了进一步验证各因素间的显著性，对正交试验结果进行单变量多因素方差分析，结果显示各因素F值均小于p（0.05），因此各因素对火龙果增殖系数的影响均达到显著性差异。通过Duncan法对各因素各水平进行多重比较（表6）可知，A因素中水平2与水平3差异不显著，但与水平1差异显著，其增殖系数从高到低依次为A3＞A2＞A1；B因素中3个水平的增殖系数均达到显著差异水平，其增殖系数从高到低依次为B3＞B2＞B1；C因素中水平水平2和水平3差异不显著，但与水平1差异达到显著性，其增殖系数从高到低依次为C1＞C3＞C2。通过方差分析筛选出最佳组合为A2B3C1，该组合正是正交试验中增殖系数最高的6号培养基。

表4 不同6-BA及NAA浓度对火龙果无菌芽诱导的影响

图1 6号培养基诱导的无菌芽

表5 广西‘金都一号’火龙果继代增殖试验结果

表6 不同大量元素、6-BA及NAA浓度对火龙果继代增殖的影响结果

综上，火龙果增殖培养基配方最佳组合为：MS＋6-BA 2.0 mg/L（即6号培养基），增殖培养1～3代苗木生长情况如图2所示。

2.4 不同培养基生根效果

生根诱导试验结果见表7所示。5号培养基生根率最高，为93.33%；其次是14号培养基，为89.44%；最差的是1、4、13号培养基，生根率不到10%。为了检验各因素之间的显著性，对试验数据进行单变量多因素方差分析，其结果显示各因素F值均小于p（0.05），因此各因素对火龙果生根率的影响均达到显著性差异。通过利用Duncan法对各因素各水平进行多重比较（表8）可知，各因素各水平对火龙果生根率的影响均达到显著性差异，最佳组合为A2B2C2D2。由于筛选的最佳组合不在正交试验中，所以补做此组合的验证试验，测得生根率为98.56%，高于正交试验中生根率最高组合A1B2C2D2（即5号培养基），苗壮根粗，分枝少。

图2 6号培养基增殖培养（从左至右，依次是第1代、第2代、第3代）

表7 广西‘金都一号’火龙果生根试验结果

表8 不同大量元素MS、ABT6、IBA及NAA浓度对火龙果生根率的影响结果

综上，火龙果生根诱导最佳培养基配方是：MS＋ABT60.5 mg/L＋IBA 0.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，生根苗木长势如图3所示。

图3 广西‘金都一号’生根培养（左图是5号培养基苗木长势，右图是调整后最佳配方）

3 讨论与结论

3.1 外植体污染问题

外植体消毒一般使用组合消毒方式，其中最常用组合是 75%酒精与 0.1%升汞［4-6，13，16］，酒精能够渗透到菌体内，使组成菌体的蛋白质凝固，从而杀死外植体表面的菌类。值得注意的是酒精浓度以75%消毒效果最佳，过低或过高浓度的酒精杀菌效果会降低很多。升汞是一种杀菌力很强的杀菌剂，主要靠汞离子进入菌类细胞内，使细胞失活或变性，从而达到消毒作用。微量的升汞还能在细胞内不断累积并最终对生物体产生毒害作用。因此，使用75%酒精与0.1%升汞组合消毒外植体时，消毒时间一定要掌握恰当，因为消毒剂在杀死菌类的同时也会杀死外植体，尤其是外植体切口处、幼嫩部位受毒害最严重［13］。本研究使用75%酒精消毒20 s、再用0.1%升汞消毒10～15 min的组合方式对火龙果外植体进行表面消毒，污染率为55.70%，这个组合方式的消毒效果最好。

火龙果茎段外植体表面光滑，芽眼的刺座处一般污染比较严重，这是因为芽眼处长有成丛的叶刺，容易窝藏较多的杂菌，虽然用毛刷刷洗，但也难以清洗干净，消毒剂也较难渗入，因此容易因消毒不彻底而造成污染［6，14］。虽然本研究对火龙果外植体进行（如移植大棚内培养、毛刷刷洗刺座处、洗洁精浸泡等）预处理，但是绝大部分污染还是出现在刺座处，因此对火龙果外植体消毒方法还需作进一步研究。

3.2 继代培养

火龙果初代培养，也叫启动培养，需要较高浓度的细胞分裂素刺激才能分化出无菌芽，当然不是越高越好，本研究中当6-BA浓度达到8 mg/L时，诱导率最高，达到85.47%，低于或高于该浓度，诱导率达不到50%。相对于初代培养，继代培养却不能使用高浓度细胞分裂素，因为容易出现畸形芽，本研究继代增殖培养基中6-BA使用浓度为2.0 mg/L时，增殖系数达到最高。除了激素外，影响继代培养的还有大量元素、微量元素及有机物，本研究就大量元素半量、全量和倍量3种不同浓度进行对比试验，其中全量和倍量表现突出，综合考虑以全量为最佳选择。因此最终筛选出火龙果继代适宜培养基为MS＋6-BA 2.0 mg/L，增殖系数为7.13。本研究结果与很多报道的结果不同［6-7，10］，如与周传明等［6］研究结果刚好相反，其诱导腋芽最佳培养基是MS＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L，最佳增殖和继代培养基均是MS＋12.0mg/L＋NAA 0.1 mg/L，这可能是不同品种适合不同的培养配方。

3.3 生根培养

火龙果为多年生肉质植物，生长旺盛，萌芽力和发枝力较强，易生气生根，此生物特性有利于其组培生根培养［15］，因此火龙果属于比较容易诱导根系的树种，但是也容易诱导出过多气生根、分枝，影响生根苗质量。火龙果生根诱导培养基中一般大量元素为半量，即 1/2［4，11，13-14］，主要是因为营养元素减少可抑制侧芽萌发，从而促进根系生长，达到诱导出根的效果。本研究中大量元素使用半量的培养基生根率达到93.33%，苗壮根粗，分枝少，效果也不错，但是通过分析及验证，最终筛选的最佳配方是MS＋ABT60.5 mg/L＋IBA 0.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，生根率达到98.56%，苗壮根粗，分枝少。因此不同品种对培养基配方要求不同，需要科技人员通过科学试验进行筛选。