猪伪狂犬病毒间接ELISA抗体检测方法的建立

刘旻翾，丁光明，付钰广，刘爱红，陈佳宁，李宝玉，曾巧英，刘光亮

(1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州730030；2.中国农业科学院兰州兽医研究所，甘肃兰州730046)

伪狂犬病(Pseudorabies，PR)，是由疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科、疱疹病毒属的PR 病毒(PRV)引起，该病原对猪、牛、羊、犬、猫等多种家畜及野生动物均易感[1]。猪是PRV 的天然宿主，各年龄段的猪均易感，不同年龄段的猪表现的症状不尽相同[2-3]。猪群一旦发生PRV 感染，病毒很难被清除，被定义为极难防疫的自然疫源性疾病，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告动物疫病。目前，一些欧洲和北美国家已将PRV 彻底净化，但该病依然是我国养猪业的重大传染病之一。

目前PRV 的检测方法主要有PCR、病毒中和试验(VNT)、血清抗体检测等[4-8]。PCR 和VNT 因不适宜于大面积的临床诊断与筛查而难以在实际生产中推广应用[9-10]。相比上述两种检测方法，血清抗体检测具有操作简单、敏感性好、能大批量检测样品等优点，易用于大规模筛查；另外，ELISA 可以使用纯化的合成肽段作为抗原底物，具有批量生产、无需处理活病毒、假阳性率低等优点[11]，因而备受临床从业人员的青睐。

现阶段，国内用于PRV 检测的市售ELISA 试剂盒主要包括OIE 推荐的进口试剂盒及一些国产试剂盒，这些产品大多基于经典型PRV 开发，而2011年以来PRV 在我国发生了变异[12-14]，因此，基于传统病毒株开发的检测试剂盒严重影响了对该病的检测与净化。鉴于此，本实验室前期分析NCBI 基因库50 株不同国家、地区、不同年份的PRV 经典株、流行株及变异株，采用DNAStar 软件对其基因同源性、氨基酸保守性、蛋白结构域及抗原性等进行分析，筛选出涵盖PRV 经典株、流行株及变异株的gB 蛋白高度保守的优势抗原表位区域，合成该肽段，并命名为gB872(氨基酸序列为： LEQQEHKA RKKNSGPALLASRVGAMATRRRHYQRLESEDPDA)。本研究以该肽段作为包被抗原，建立检测PRV 抗体的间接ELISA 方法，为PRV 的防控提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 PRV 标准阴阳性血清为本实验室制备保存备用；16 份疫苗免疫抗体阳性血清采自四川祁阳某猪场；1 份PRV 野毒感染猪阳性血清和50 份阴性血清由中国农业科学院兰州兽医研究所畜禽重要人兽共患病团队惠赠；50 份PRV 抗体阳性血清，由中国农业科学院兰州兽医研究所宿主抗病毒感染然与免疫生物学团队惠赠。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、O 型口蹄疫病毒(serotype O FMDV)等阳性血清由兰州兽医研究所口蹄疫防控技术团队惠赠；90 份临床血清样品采自青海某仔猪繁育基地。

肽段PRV gB872由上海吉尔生物技术有限公司合成；羊抗猪IgG-HRP 购自美国SouthernBiotech 公司；TMB 底物显色液购自BioFX 公司；96 孔可拆式酶标板购自Corning 公司；BSA 购自BioFROXX公司；PRV gB 蛋白抗体ELISA 检测试剂盒购自荷兰BioCheck 公司；IDEXX PRV/ADV gI (gE)抗体检测盒、IDEXX PRV/ADV gB 抗体检测试剂盒均购自美国IDEXX 公司。

1.2 PRV-gB 间接ELISA 的优化结果 使用棋盘法对gB872抗原包被浓度(50 ng/100 μL～400 ng/100 μL)，PRV 阳性血清稀释度(1∶25～1∶400)进行优化；在确定抗原包被浓度及一抗稀释比后，进一步对羊抗猪HRP-IgG (1∶1 000～1∶10 000)、底物显色时间(3 min～11 min)进行优化，根据P/N 值的高低确定最佳反应条件。在确立该抗原最优条件后，根据P/N 值选择综合评价最高的实验结果为该方法最佳反应条件。

1.3 PRV-gB 间接ELISA 阴阳性判定标准的建立利用已优化的PRV 间接ELISA 方法，对PRV 阳性、阴性血清样品各50 份检测OD450nm值，并计算标准阴阳性血清OD450nm的差值，分别计算出标准阴、阳性血清的平均OD450nm值，以S/P 值作为判定阴阳性标准。

1.4 特异性试验 按已建立的PRV 间接ELISA 方法检测PRRSV、PCV2、CSFV、FMDV(O)阳性猪血清，各设置3 个重复，同时设立PRV 阳性血清及阴性血清为对照，评价该方法的特异性。另采用荷兰BioCheck 公司试剂盒检测各血清，比较二者结果。

1.5 敏感性试验 取PRV 阳性血清按1∶2～1∶2 048进行2 倍倍比稀释，分别利用建立的ELISA 方法和PRV/ADV gB 抗体检测试剂盒进行检测，评估本研究建立的ELISA 方法的敏感性。

1.6 重复性试验 选取5 份血清样品，用同一批次包被的3 个不同ELISA 板进行批内重复性检测；另采用3 个不同批次包被的ELISA 板对上述5 份血清样品，利用建立的ELISA 方法进行批间重复性检测，计算批内或批间变异系数(CV=SD/X×100 %)，评估该ELISA 检测方法的重复性。

1.7 临床样品的检测 利用已建立的PRV 间接ELISA 方法对90 份临床血清样品分别进行检测，每份血清设置2 个重复。同时利用OIE 推荐的荷兰BioChek PRV-gB 检测试剂盒对以上临床样品进行检测，比较二者检测结果，并计算两种ELISA 方法的符合率。

1.8 PRV 野毒感染及疫苗免疫血清的检测 利用IDEXX PRV/ADV gI (gE)抗体检测试剂盒及IDEXX PRV/ADV gB 抗体检测试剂盒分别对1 份野毒感染猪阳性血清及16 份免疫猪血清同时检测，然后根据以上试剂盒检测结果相互交叉验证，进一步确定并区分所获阳性血清中的PRV 野毒感染血清和疫苗免疫血清(因荷兰BioChek 公司PRV 抗体检测试剂盒无法区分野毒感染与疫苗免疫产生的抗体，所以利用美国IDEXX 公司的2 个检测试剂盒进行交叉验证，以区分野毒感染血清及疫苗免疫血清)；最后使用本研究建立的方法再次检测上述样品，并与上述结果比较，验证本研究建立的方法对野毒感染及疫苗免疫血清的检测结果。

2 结 果

2.1 PRV-gB 间接ELISA 反应条件优化结果 使用棋盘法优化的各反应条件如下：最佳抗原包被浓度为：200 ng/100 μL；包被时间为37 ℃、2 h；最佳封闭物为2.5 % BSA；待检样品最佳稀释比为1∶100，最佳孵育时间为37 ℃、0.5 h；羊抗猪HRPIgG 最佳稀释度为1∶5 000，最佳孵育时间为37 ℃，2 h；底物最佳显色条件为37 ℃、5 min。

2.2 PRV-gB 肽段间接ELISA 试剂盒临界值的确定 利用建立的PRV gB 间接ELISA 方法检测PRV阳、阴性血清样品，计算阴性血清与阳性血清OD450nm差值，根据公式S/P=(样本OD450nm值-OD450nm阴性对照平均值)/(阳性对照平均OD450nm值-OD450nm阴性对照平均值)以及阴阳性血清的检测结果，计算确定S/P≥0.56 为阳性， S/P<0.56 为阴性(图略)。

2.3 特异性试验 应用本实验建立的ELISA 方法与荷兰BioCheck 公司的同类产品对PRRSV、PPV、PCV 2、CSFV、FMDV(O)，PRV 阳性血清样品进行平行检测，结果显示除PRV 阳性血清结果为阳性外，其它结果均为阴性(图1)，BioCheck 试剂盒的检测结果与本实验室建立的ELISA 方法结果一致。表明本研究建立的ELISA 方法特异性较强。

图1 本实验建立的ELISA 与国外商品化试剂盒特异性比对分析Fig.1 Comparative analysis between commercialized ELISA kits and the kit developed in this study

2.4 敏感性试验 利用本实验建立的间接ELISA方法对不同稀释度的PRV 阳性血清检测，结果显示该ELISA 方法对PRV 阳性血清的最低检测稀释度为1∶128；而相同条件下IDEXX PRV/ADV gB 抗体检测试剂盒检测下限为1∶4 (图2)。表明本实验建立的间接ELISA 方法的敏感性较高。

图2 ELISA 敏感性试验结果Fig.2 The sensitivity test of the indirect ELISA

2.5 重复性试验 利用本实验的间接ELISA 方法进行重复试验，结果显示，批内变异系数(CV)为7.57%～9.81%，批间变异系数为2.82%～8.71% (表1)， 均小于10 %。表明建立的间接ELISA 具有良好的重复性。

表1 间接ELISA 重复性试验(n=5)Table 1 Reproducibility assay for indirect ELISA (n=5)

2.6 临床样品的检测结果 将采集的90 份临床样本利用本实验建立的间接ELISA 方法与荷兰BioChek 公司产品进行同时检测，结果显示本实验建立的间接ELISA 方法与BioChek PRV-gB 检测试剂盒的阳性符合率为100%，阴性符合率为97.67%，总体符合率为97.78 % (表2)。表明本研究建立的方法可以用于临床样品的检测。

表2 两种ELISA 方法对临床样品的检测结果Table 2 Calculation of coincidence rate

2.7 PRV 野毒感染与疫苗免疫阳性血清样品的检测结果 利用本实验建立的间接ELISA 方法与IDEX 试剂盒对1 份野毒感染阳性血清样品及16 份疫苗免疫阳性血清样品检测结果显示：a.针对野毒感染血清样品，IDEXX-gI(gE)试剂盒及IDEXX-gB试剂盒检测结果均呈阳性，本实验室建立的间接ELISA 方法检测该样品也呈阳性；b.针对疫苗免疫血清样品，IDEXX-gI(gE)试剂盒检测结果呈阴性，IDEXX-gB 试剂盒及本实验室建立的间接ELISA 方法检测该样品均呈阳性。本方法对野毒感染阳性血清和疫苗免疫阳性血清均可以检测出，与IDEXX 两种试剂盒的结果一致(表3)，但无法区分野毒感染血清和疫苗免疫血清。

表3 本方法与商品化试剂盒检测PRV 野毒感染血清与疫苗免疫血清比对分析结果Table 3 Comparative analysis of antibody detection from PRV vaccinated or infected serum

3 讨 论

PR 广泛分布于世界各国，是对全世界养猪业危害最严重的疾病之一。目前PR 的防控主要靠gE/gI基因缺失疫苗免疫，采用gB-ELISA 对猪群进行血清抗体检测[15]。然而，这些ELISA 检测方法大多基于经典型PRV 设计，而2011 年以来PRV 在我国发生了大量变异[12-14]，因此，基于经典株开发的检测试剂盒严重影响了对该病的检测及疫苗免疫效果的有效评价。目前市售gB-ELISA 检测试剂盒多数是基于5 个抗原表位中的1 个或者2 个建立的阻断ELISA，但近年来PRV 变异株的出现并流行使得gB具有一定的抗原漂移性，并且猪个体间对gB 不同表位的抗体应答也显示出多样性，因此阻断ELISA方法可能会出现一定比例的误判[16-17]。本实验从gB高度保守的抗原表位区筛选出优势表位区段，合成高纯度多肽gB872(氨基酸序列为：LEQQEHKAR KKNSGPALLASRVGAMATRRRHYQRLESEDPDA)，以此为包被抗原建立了ELISA 检测方法，旨在提高ELISA 检测方法的广谱性、特异性及敏感性，避免市售试剂盒无法准确识别目前流行的国内变异毒株的缺陷，有效地解决了误判问题的产生。

本实验采用间接ELISA 技术建立PRV 的检测方法与市售的检测试剂盒进行比较，显示二者阳性符合率为100 %，阴性符合率为97.67 %，表明建立的间接ELISA 方法敏感性较高；且采用该方法对PRSV、PPV、PCV2、CSFV、FMDV(O)阳性、PRV阴性血清进行特异性试验时发现，本实验建立的ELISA 方法与BioCheck 公司产品检测结果完全一致，无假阳性或交叉反应发生。

经对临床样品检测结果统计分析显示，本研究建立的ELISA 方法与OIE 推荐的BioCheck PRV-gB间接ELISA 试剂盒比较，不存在显著性差异，完全可以替代进口试剂盒。同时，该检测方法可同时检测由经典株、流行株感染及疫苗免疫产生的抗体，有利于在我国动物疫病防控一线推广应用。本研究以PRV gB 蛋白设计的肽段为包被抗原，建立的间接ELISA 方法具有更好的应用价值及市场开发前景。