动物A型流感病毒RPA-LFD可视化检测方法的建立

刘文俊，阳佑天，易华东，邓汝森，杨培洁，付新亮，黄运茂，田允波

(1.仲恺农业工程学院动物科技学院，广东广州510225；2.广东省水禽健康养殖重点实验室，广东广州510225；3.佛山科学技术学院医药工程学院，广东佛山528000)

流感(Influenza)是由流感病毒(Influenza virus，IV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。IV属于RNA 病毒的正粘病毒科，根据病毒的蛋白抗原性不同，可以分为A、B、C 三型[1]。其中A 型IV 的危害最大，该病毒可感染禽、猪、马、犬、猫等动物，对我国养殖业的健康发展造成了重大的威胁。同时，动物A 型IV 可跨宿主传播感染人类，严重威胁了人类的健康安全[2]。因此如何快速有效的检测动物中的A 型IV 引起越来越多人的关注。

目前，IV 的检测方法主要有传统的病毒分离方法和基于分子技术的RT-PCR 方法、荧光定量RT-PCR 方法、RT-LAMP 方法等，以及ELISA、免疫荧光、免疫胶体金试纸条等免疫学检测方法[3]。其中荧光定量RT-PCR 方法因其较高的灵敏度和准确性，被作为动物A 型IV 的国标检测方法得到了广泛的应用[4]。但传统的核酸检测方法大多需要复杂的仪器设备，专业的操作人员和较长的检测等待时间，无法满足快速诊断疾病的需求。因此，建立一种准确、可靠、无需任何仪器设备的快速核酸检测方法显得尤为重要。伴随着现代分子生物学的发展，重组酶聚合酶扩增(RPA)检测技术得到了快速的发展，该技术利用可分离DNA 双链的重组酶蛋白、稳定开放复合物的单链DNA 结合蛋白(SSB)以及DNA 聚合酶进行扩增。整个反应过程在30 ℃～40 ℃的条件下进行，无需任何仪器设备，仅利用人体体温10 min～20 min 内即可完成检测。具有快速、高效、稳定的优点，被誉为下一代检测方法[5]。

本研究以动物A 型IV M 基因的保守区域为靶标，并结合侧吸层流胶体金试纸条技术(LFD)，建立了可在20 min 内检测动物A 型IV 的RPA-LFD 可视化检测方法，为临床快速诊断提供技术手段。

1 材料与方法

1.1 病 毒 A 型IV (H9N2、H6N6)、小鹅瘟病毒(GPV)、新城疫病毒(NDV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)及病毒核酸样品(鸭肝炎病毒、H1 亚型、H5亚型、H7 亚型IV)均由广东省水禽健康养殖重点实验室保存。50 份鸭咽拭子样品采集自广州市从化区某活禽交易市场。

1.2 主要试剂 MiniBEST Viral RNA/DNA 提取试剂盒、primeScriptTMRT Master Mix 反转录试剂盒、ExTaqDNA 聚合酶、DNA Marker、pMD18-T 载体、DH5α 感受态细胞和琼脂糖均购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒均购自OMEGA 公司。TwistAmp nfo 试剂盒购自TwistDX 公司；一次性侧流层析试纸条检测装置(LFD)购自杭州尤思达公司。

1.3 病毒RNA 的提取和M 基因重组质粒的构建根据RNA/DNA 提取试剂盒说明书提取1.1 中各病毒RNA 或DNA，将抽提的RNA 反转录成cDNA 后保存于-80 ℃冰箱。根据NCBI A 型IV M 基因序列(AB972718)，设计引物P1：5'-ATGAGTCTTCTAAC CGAGGT-3'/P2：5'-CTCCAATCCTATGTTGACAA-3'，以禽H9N2 IV cDNA 为模板，扩增M 基因全长序列，PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测后胶回收纯化，连接pMD18-T 载体，酶切鉴定阳性重组质粒使用Epoch 超微量分光光度计测定其浓度，并根据公式copies/μL=con.(ng/μL)×6.02×1023×10-9/660×bases 计算出重组质粒标准品的拷贝数，作为阳性质粒标准品保存备用。

1.4 RPA 引物和探针的设计与筛选 根据NCBI 中登录的近5 年不同基因型的流感病毒株序列，通过clustalW 软件(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)比对选择IV M 基因的相对保守区域，设计多对引物和探针，由上海生工股份有限公司合成及标记。采用设计的引物和探针，按TwistAmp nfo 试剂盒说明书，在PCR 反应管中添加Rehydration Buffer 29.5 μL，LF Probe 0.6 μL (10 μmol/L)，上下游引物各2.1 μL(10 μmol/L)，ddH2O 12.2 μL，将所有组分混合后，加入预添加nfo 酶的PCR 反应管中，混匀后加入1 μL 模板(H9N2 IV cDNA 为阳性模板，去离子水为阴性模板)，最后加入2.5 μL 醋酸镁，在37 ℃条件下反应25 min。通过2 %琼脂糖凝胶电泳检测反应产物，通过电泳条带初步筛选出合适的引物和探针(表1，图1)。将筛选出的上下游引物在NCBI blast数据库进一步验证和预测。

表1 RPA-LFD 方法引物及探针核苷酸序列Table 1 Recombinase polymerase amplification primers and probe used in this study

图1 RPA 引物设计位点示意图Fig.1 Map of RPA primer design sites

1.5 RPA-LFD 检测方法的优化 按照1.4 中所述，将筛选得到的引物和探针按TwistAmp nfo 试剂盒说明书推荐的反应体系及条件进行反应，将反应产物放置于一次性侧吸层流检测装置中，按下装置上的手柄，装置底部的刀片会同时切开PCR 反应管和装有流动相液体的胶囊，被稀释的反应产物流到预先被FAM 抗体标记质控线和biotin 抗体标记检测线的试纸条上。由于下游引物与探针的扩增片段同时被FAM 和biotin 标记，能与胶体金标记的抗FAM 抗体形成三元复合物结合在含biotin 抗体的检测线上，而未扩增的FAM 标记探针形成不含biotin 的两元复合物，结合在含FAM 抗体的质控线上，检测结果判定标准为：若为两条带即为阳性扩增，若仅有一条带表明则为阴性[6]。正确的RPA 扩增产物进一步利用2 %琼脂糖凝胶电泳，预期有两条特异性条带：其中一条为主带，其大小与上下游引物之间的片段大小一致，210 bp；另一条带是由核酶nfo 切割探针与下游引物共同扩增形成，其大小与探针和下游之前的片段大小一致，143 bp；阴性产物无特异性条带。

同时，利用方阵试验确定最佳反应温度(30 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃)和最佳反应时间(5 min、10 min、15 min、20 min、25 min)。

1.6 特异性试验 采用本实验建立的RPA-LFD 方法，对A 型IV 核酸(H1 亚型、H5 亚型、H6 亚型、H7 亚型和H9 亚型)以及GPV、NDV、DTMUV 和DHV 等家禽常见疫病病原进行特异性检测，评价其特异性。

1.7 敏感性试验 将构建的质粒标准品10 倍倍比稀释(106拷贝/μL～101拷贝/μL)后作为模板，利用本实验建立的RPA-LFD 方法与基于引物P1/P2 的常规PCR 方法进行检测，同时设无菌水为阴性对照。对两种检测方法的结果进行分析，评估本实验建立的RPA-LFD 方法的敏感性。

1.8 临床样品检测 按常规方法分别提取50 份鸭咽拭子样品核酸反转录后作为模板，利用本实验建立的RPA-LFD 方法和常规PCR 方法进行检测，设H6 亚型IV 核酸为阳性对照，无菌水为阴性对照，比较两种方法的检测结果，计算二者的符合率。同时，根据A 型IV 基因保守区域设计HA 基因扩增引物：HA-F：5'-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGC AGGGG-3'/HA-R：5'-ATATCGTCTCGTATTAAGTAG AAACAAGGGTGTTTT-3'，以上述咽拭子样品的cDNA 为模板，扩增并测序病毒的HA 片段。最终将采集的样品经双抗处理后，离心取上清接种9 日龄鸡胚，48 h 后收集存活鸡胚的尿囊液，进行红细胞凝集试验和RT-PCR 方法鉴定。

2 结 果

2.1 重组M 基因质粒的构建 以P1/P2 为引物进行PCR 扩增，结果显示得到约1 000 bp 的条带，与预期相符(图略)。将目的片段连接PMD18-T 载体，经Hind Ⅲ/BamHⅠ双酶切鉴定，结果显示得到与目的片段大小相符的酶切产物(图2)，表明重组质粒标准品pMD18-M 正确构建。经测定质粒浓度为217 ng/μL，经计算其拷贝数为5.38×1010拷贝/μL。

2.2 RPA-LFD 方法的建立 按TwistAmp nfo 试剂盒方法筛选出的最佳引物及探针(表1)，并利用Blast 对引物进行进一步分析。结果显示，RPA-LFD检测结果阳性有2 条带，阴性仅有1 条带，符合预期的判定标准(图3A)。正确的RPA 扩增产物利用2%琼脂糖凝胶进行电泳，结果显示有两条特异性条带，其中一条主带大小为210 bp，另一条带大小为143 bp，阴性产物无特异性条带，与预期一致(图3B)。Blast 结果显示此对引物理论上能够与H1～H16/N1～N9 等多种IV 反应。因此确定该对引物及探针为最佳。

图2 重组M 基因质粒的酶切鉴定Fig.2 Enzyme digestion identification of recombinant M gene plasmid

图3 RPA-LFD 方法的建立Fig.3 Establishment of RPA-LFD detection method

2.3 RPA-LFD 最佳反应条件的确定 进一步利用方阵试验确定最佳反应温度，反应时间，结果显示该检测方法可以在30 ℃～40 ℃正常进行，其中35 ℃的检测条带颜色最明显(图4A)。由于35 ℃与人体表温度接近，适宜用手握持完成反应，因此选择35 ℃作为最佳反应温度。在35 ℃条件下，10 min 左右即可呈现肉眼可辨别的条带，但较为暗淡，条带的亮度随着时间的增加不断增强(图4B)，综合各因素，选择15 min 作为RPA 反应的时间。

2.4 特异性试验结果 为评估RPA-LFD 检测方法的特异性，采用确定的最佳反应条件，以A 型IV核酸(H1 亚型、H5 亚型、H6 亚型、H7 亚型和H9亚型IV)以及GPV、NDV、DTMUV 和DHV 等家禽常见疫病病原核酸为模板进行RPA-LFD 检测。结果显示，除各A 型IV 均为阳性外，其余病原检测结果均为阴性(图5)，表明所建立的RPA-LFD 检测方法具有较强的特异性。

图4 RPA-LFD 扩增条件的确定Fig.4 Determination of RPA-LFD amplification condition

图5 RPA-LFD 特异性分析Fig.5 Specific analysis of RPA-LFD

2.5 敏感性试验结果 以10 倍倍比稀释的质粒标准品(106拷贝/μL～101拷贝/μL)为模板，分别采用建立的RPA-LFD 方法和常规PCR 方法进行检测。结果显示RPA-LFD 方法的检测下限为10 拷贝/μL，常规PCR 方法的检测下限为103拷贝/μL，RPALFD 方法比常规PCR 方法敏感性高约100 倍(图6)。表明该RPA-LFD 方法敏感性较高。

图6 RPA-LFD 敏感性的比较Fig.6 Comparison of the RPA-LFD sensitivity

2.6 临床样品检测结果 将50 份采集的鸭咽拭子样品提取核酸并反转录后，按本实验建立的RPALFD 方法以及常规PCR 方法分别进行检测，结果显示两种方法均检测到3 份阳性样品，其余47 份样品均为阴性，符合率为100 %。阳性样品HA 基因经PCR 扩增后测序，结果显示3 份阳性样品均为H6亚型低致病IV，与最终的病毒分离鉴定结果相一致。表明本研究建立的RPA-LFD 检测方法准确性高，可用于临床检测。

3 讨 论

A 型IV 因其宿主广泛，可以感染人、家禽、猪、马以及伴侣动物，且基因亚型众多变异迅速，被全世界广泛关注[7]。根据A 型流感病毒表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)这两种主要病毒抗原的特性可分为多个亚型。野生水禽被认为是A 型H1～H16 和N1～N9 IV 的主要储存库，近年来，在蝙蝠中也有H17N10 和H18N11 等亚型病毒分离的报道[1,8]。如何快速准确的检测IV 是疾病防控的关键环节。

本实验建立的动物A 型IV RPA-LFD 快速检测方法，在35 ℃等温条件下20 min 内即可得到检测结果，整个检测过程不需要大型的仪器设备，结果可通过肉眼直接辨别。其特异性和敏感性均良好。与快速简易的RNA 提取试剂盒相搭配，可以在现地完成疾病的诊断和初步筛查。RPA 技术不但具有快速、高效、便捷的特点，且具备非常高的稳定性，重组酶冻干粉放入搭配的储存管中，可以在室温保存长达3 周[9]。目前，RPA 检测方法被越来越多学者所关注，并建立了多种疫病的该检测方法[7,10-11]。虽然RPA 检测方法具有较多的优势，但值得注意的是RPA 检测方法的引物目前并没有合适的设计软件，也没有明确的设计原则，仅有试剂盒生产厂家的简单指导意见。RPA 引物的长度要求在30 个碱基以上，探针的长度要求在48 个碱基以上，较难避免引物二级结构的形成。同时，RPA-LFD 检测方法引物设计要尽量避免探针和下游引物发生反应导致的假阳性[12]。在本实验过程中，设计的多组引物均出现不能正常反应或者假阳性的情况。一般需要设计多组引物进行筛选，以获得较佳的引物组合。

本实验利用RPA 技术建立了一种等温、快速、可视化的动物A 型IV RPA-LFD 检测方法，并对该方法进行验证。利用该方法对50 份临床样品进行检测，结果与PCR 及病毒分离结果一致。该方法不依赖任何仪器设备，可为动物A 型IV 的现地快速检测、流行病学研究提供参考。