副猪嗜血杆菌及巴氏杆菌双重荧光定量PCR检测方法的建立

姜睿姣，周丽军，邬旭龙，张鹏飞，罗梓丹，肖 璐，王 印,2，姚学萍,2，杨泽晓,2，罗 燕,2

(1.四川农业大学动物医学院，四川成都611130；2.动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川成都611130)

副猪嗜血杆菌病又名革拉泽氏病(Gl覿sser's disease)，由副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，Hps)引起。它是猪上呼吸道的一种共栖菌[1-2]，在猪抵抗力较低的情况下侵入体内。常引起猪的浆液性或纤维素性多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎、高热、呼吸道紊乱等症状，严重时致死。猪巴氏杆菌病(Swine pasteurellosis)又称猪肺疫，俗称“锁喉风”或“肿脖子瘟”，是由多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)引起的重要传染病，该菌也常定居于猪的上呼吸道中，体温失调、抵抗力降低、生长环境恶劣、极端天气是该病的主要诱因。严重时猪出现犬坐姿势张口呼吸，引起肺炎、呼吸困难。

两种细菌均能够引起猪的发热、呼吸困难、咳嗽、关节肿胀，主要能致猪肺部产生出血以及纤维素渗出物等相似的病理变化。近几年，该两种疾病已经对养猪业造成了重大的经济损失[3-4]，虽然有分别检测该两种疾病的常规PCR 方法[5-6]，但在实际应用中其存在着操作繁琐、耗时较长等问题。因此，高效、快速、准确的检测方法能够为后续的治疗及防控节约更多的时间，最大程度地减小经济损失。

荧光定量PCR (qPCR)依靠它灵敏性高、特异性强、反应时间短等诸多优点在疾病检测早期具有极大的优势[7-8]。此外，其还具有操作简单、结果观察方便等优点，能够实时反映PCR 扩增进程，无需对PCR 扩增产物再处理[9]。双重及多重荧光定量PCR是在荧光定量PCR 上发展起来的，它在同一时间、同一体系内，能够根据不同需求扩增不同数目的靶标，更大程度地提高了扩增的效率，缩短了检测时间。

目前，多重荧光定量PCR 已经应用于多种疾病的检测：林碧莲等通过多重荧光定量PCR 快速检测婴幼儿奶粉中的沙门氏菌、克罗诺杆菌和金黄色葡萄球菌[10]；Hu 建立了同时检测8 种食源性致病菌的多重荧光定量PCR 方法[11]；Park 等建立了鱼类和水产品中5 种弧菌的多重荧光定量PCR 检测方法[12]；何世成等建立了同时检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒2 型的多重荧光定量PCR 方法[13]。本研究拟建立一种同时检测Hps 和Pm 的双重荧光定量PCR 方法，为临床快速、准确排查疫情提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 Hps、Pm、胸膜肺炎放线杆菌、猪沙门氏菌、猪链球菌、猪丹毒丝菌、大肠杆菌、疑似感染Hps 的15 份病死猪肺组织、疑似感染Pm 的10 份病死猪肺组织、3 份人工混合感染Hps、Pm 的猪肺组织及胸腔积液均由四川农业大学动物检疫实验室提供。DH5α 感受态细胞、细菌基因组DNA 提取试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒、普通质粒小提试剂盒均购自天根生化科技有限公司；pMD19-T 载体、2×TaqPCR Master Mix、DL2000 DNA Marker 购自宝生物工程(大连)有限公司；SsoAdvanced Universal Probe Supermix 购自Biorad 公司。

1.2 引物及TaqMan 探针的设计与合成 参考GenBank 中已登录的 Hps (FJ416469.1)及 Pm(EF219454.1)的基因序列，选取Hps 的OmpP2基因、Pm 的PlpE基因作为检测靶序列，利用软件Primer Premier 5 设计两对特异性引物及TaqMan 探针(表1)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 引物及TaqMan 探针序列信息Table 1 Sequences of oligonucleotides primers and TaqMan probes

1.3 重组质粒标准品的构建与鉴定 将Hps 涂布于含10 %胎牛血清、1 μL/mL NAD+的TSA 中，37 ℃培养24 h；Pm 涂布于含5 %胎牛血清、1 μL/mL NAD+的TSA 中，37 ℃培养24 h。挑取单个菌落连续纯化3 次。用生理盐水洗脱纯培养物，提取菌株DNA，-20 ℃保存备用。采用特异性引物OmpP2-F/OmpP2-R 和PlpE-F/PlpE-R 分别PCR 扩增两种菌的目的基因，经1 %琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的片段，克隆至pMD19-T 载体，阳性克隆由上海生工生物工程技术服务有限公司测序鉴定，构建的重组质粒分别命名为Hps-CZ、Pm-CZ。利用Nano Drop 2000 核酸蛋白分析仪测定两种重组质粒标准品浓度，并计算其拷贝数[14]。

1.4 单一荧光定量PCR 方法的优化及标准曲线的建立 以Hps-CZ 和Pm-CZ 为模板，采用各自的引物与探针(OmpP2-F/OmpP2-R/OmpP2-P 和PlpE-F/PlpE-R/PlpE-P)，分别进行两种菌的单一荧光定量PCR 扩增。反应体系均为20 μL，依次对引物浓度(0.1 μmol/L ～1.0 μmol/L)、TaqMan 探针浓度(0.2 μmol/L～1.0 μmol/L)、退火温度(56 ℃～62 ℃)进行优化。按照优化好的反应条件，将两种重组质粒标准品分别稀释至102拷贝/μL～108拷贝/μL 并作为模板，分别进行荧光定量PCR 扩增。以循环数为纵坐标、模板稀释度为横坐标，建立单一荧光定量PCR 的标准曲线。

1.5 双重荧光定量PCR 的优化及建立 以构建的单一荧光定量PCR 方法为基础，取各组分最优浓度为参照标准，按照矩阵试验确定最佳双重荧光定量PCR 反应条件。反应体系为20 μL：2×SsoAdvanced Universal Probe Supermix 10 μL，优化上、下游引物浓度(0.4 μmol/L～0.8 μmol/L)、TaqMan 探针浓度(0.5 μmol/L～1.0 μmol/L)，模板各2 μL，ddH2O 补足20 μL。PCR 反应条件：95 ℃5 min；95 ℃10 s，在56 ℃～62 ℃优化退火温度时间并设置为30 s，40 个循环，延伸时采集荧光信号。

1.6 双重荧光定量PCR 标准曲线的建立 将两种重组质粒标准品分别稀释至103拷贝/μL～108拷贝/μL，相同拷贝数的标准质粒以相同体积混合作为模板，利用本研究建立的双重荧光定量PCR 扩增，以循环数为纵坐标、模板稀释度为横坐标，建立双重荧光定量PCR 的标准曲线。

1.7 特异性试验 提取本实验室保存的胸膜肺炎放线杆菌、沙门氏菌、猪链球菌、猪丹毒丝菌、大肠杆菌、Hps、Pm 基因组DNA 并作为模板，同时以两种重组质粒标准品作为阳性对照，以ddH2O 作为阳性对照，采用本研究建立的双重荧光定量PCR 方法进行扩增，以评估该方法的特异性。

1.8 敏感性试验 将两种质粒标准品分别10 倍倍比稀释至101拷贝/μL～108拷贝/μL 并分别以其为模板，按照本研究建立的双重荧光定量PCR 方法扩增。同时将上述各稀释度的重组质粒标准品作为模板采用各菌株的单一荧光定量PCR 及常规PCR[5]分别进行扩增，将各检测结果比较分析，以确定该方法的敏感性。

1.9 重复性试验 取浓度为103拷贝/μL～107拷贝/μL 的两种质粒标准品为模板，采用建立的双重荧光定量PCR 进行组内重复性试验，试验重复3 次；取上述重组质粒标准品为模板，在3 个不同的时间采用该方法，进行组间重复试验，试验重复3 次。计算每一次反应的Ct 值(或Cq 值)的标准偏差(SD)和变异系数(CV)，以此评估所建立方法的稳定性和重复性。

1.10 临床样品检测 取实验室保存的28 份疑似感染组织样品、3 份人工混合感染样品，提取细菌基因组后作为模板，分别用建立的双重荧光定量PCR法、常规PCR 法、细菌分离鉴定检测，以此验证建立方法的可行性与可靠性。

2 结 果

2.1 重组质粒标准品的构建与鉴定 采用特异性引物PCR 扩增Hps 的OmpP2基因、Pm 的PlpE基因。结果显示，Hps 和Pm 经扩增分别得到约150 bp 和约140 bp 的目的条带(图1)。将PCR 产物回收纯化后，分别克隆至pMD19-T 载体构建两株菌的重组质粒标准品Hps-CZ、Pm-CZ，经测序鉴定未发现OmpP2、PlpE基因突变，结果与预期相符。表明正确构建了质粒标准品Hps-CZ、Pm-CZ，经计算，两种质粒标准品分别为5.60×1010拷贝/μL、7.58×1010拷贝/μL。

图1 重组质粒标准品的PCR 鉴定结果Fig.1 Identification of standard plasmids by PCR

2.2 两株菌单一荧光定量PCR 方法及标准曲线的建立 经优化后，建立了Hps、Pm 单一荧光定量PCR 方法。体系为20 μL，Hps 和Pm 上下游引物各0.8 μL (0.4 μmol/L)、1.2 μL (0.6 μmol/L)，TaqMan探针均为1.2 μL(0.6 μmol/L)，质粒标准品各1.5 μL，Mix 10 μL，ddH2O 补足20 μL。扩增条件：95 ℃5 min，95 ℃10 s，退火温度分别为58 ℃、62 ℃30 s，共39 个循环。Hps 标准曲线：Y=-3.342X+38.975，E=99.2 %，R2=0.999；Pm 标准曲线：Y=-3.141X+37.636，E=108.2 %，R2=0.998，结果表明两种质粒标准品在102拷贝/μL～108拷贝/μL 范围内具有良好的线性关系。

2.3 双重荧光定量PCR 方法的建立 通过矩阵试验最终确定了双重荧光定量PCR 方法的最佳反应条件。在20 μL 反应体系中，Hps 上下游引物各1.2 μL(0.6 μmol/L)，Pm 上下游引物各0.8 μL(0.4 μmol/L)，TaqMan 探针分别为Hps 0.8 μL (0.4 μmol/L)、Pm 1.0 μL(0.5 μmol/L)，质粒标准品各1.5 μL，Mix 10 μL，ddH2O 补足20 μL，扩增条件为：95 ℃5 min；95 ℃10 s，58 ℃30 s，共39 个循环。

2.4 双重荧光定量PCR 标准曲线的建立 取103拷贝/μL～108拷贝/μL 6 个浓度梯度的等体积混合重组质粒标准品作为模板，利用优化的反应条件进行双重荧光定量PCR 扩增，绘制标准曲线。Hps 标准曲线相关系数R2为0.999，标准曲线方程为Y=-3.371X+39.258，扩增效率为98.0 %。Pm 的标准曲线相关系数R2为0.999，标曲方程为Y=-3.284X+37.988，扩增效率为101.6 % (图2)。表明：两种重组质粒标准品混合物在上述浓度范围内，与Ct 值具有良好的线性关系。

图2 双重荧光定量PCR 标准曲线(--：Hps；——：Pm，下同)Fig.2 Standard curve of the duplex qPCR(--: Hps; ——: Pm, the same as below)

2.5 特异性试验结果 以两种重组质粒标准品作为阳性对照，利用建立的双重荧光定量PCR 方法，对实验室保存的胸膜肺炎放线杆菌、沙门氏菌、猪链球菌、猪丹毒丝菌、大肠杆菌、Hps、Pm 的基因组DNA 进行扩增。结果显示，该双重荧光定量PCR仅对Hps、Pm 以及两种重组质粒标准品有特异性扩增，其余样品均为阴性(图3)。表明该方法特异性较强。

2.6 敏感性试验 采用常规PCR 法、单一及双重荧光定量PCR 方法，分别对101拷贝/μL～108拷贝/μL 两种重组质粒标准品进行敏感性检测。结果显示，双重荧光定量PCR 方法对Hps 和Pm 的检测限分别是5.60×102拷贝/μL 和7.58×102拷贝/μL 重组质粒标准品，与单一荧光定量PCR 检测数量级相同(图4A、4B)。表明两种不同特异性引物间干扰较小，多重体系中PCR 扩增效率几乎未受影响。常规PCR 结果显示对两种质粒的检测限均约为104拷贝/μL，比荧光定量PCR 敏感性低100 倍(图4C)，表明荧光定量PCR 的敏感性较高，且高于常规PCR近100 倍。

图3 特异性试验(--：Hps；——：Pm)Fig.3 Specific test of the duplex qPCR (--: Hps; ——: Pm)

2.7 重复性试验 以103拷贝/μL～107拷贝/μL 的两种重组质粒标准品混合物为模板，采用建立的双重荧光定量PCR 方法分别进行组内和组间重复性试验，每组试验重复3 次。结果显示组内变异系数小于2 %，组间变异系数小于2.5 % (表2)。表明建立的双重荧光定量PCR 方法具有较好的重复性。

2.8 临床样品检测 分别采用建立的双重荧光定量PCR 法、常规PCR 法、细菌分离鉴定检测临床28份样品。结果显示，双重荧光定量PCR 方法的阳性检出率为53.57 % (15/28)，优于常规PCR 方法的46.42 % (13/28)，且明显高于细菌分离鉴定方法28.57 % (8/28)(表3)，表明双重荧光定量PCR 方法敏感性更高，可以用于临床样品的检测率。

3 讨 论

近年来，Hps 已经成为规模化养殖条件下引起保育猪死亡的典型细菌性疾病之一[3,15]，Pm 感染导致的猪肺疫也是引起猪死亡的一种常见传染病，这两种细菌性疾病在世界各地均有发生，且均能够引起猪的呼吸道症状[16-17]。由于养殖场在猪发病后多使用大量抗生素，导致其细菌分离培养困难、分离鉴定准确性低，再加之一些细菌对生长条件要求苛刻、生长缓慢，这不仅给疾病的诊断带来了挑战，还给养猪业造成重大的经济损失。近几年实验室检测的临床样本中，Hps 及Pm 的检出率较高、比重偏大，且两种细菌分离培养均较困难，因此为了提高检测的效率及准确性，本研究结合分子生物学手段，在已有检测方法的基础上，建立了同时检测该两种细菌的双重荧光定量PCR 方法。

图4 敏感性试验结果Fig.4 Sensitivity tests of the double qPCR, Single qPCR and conventional PCR

表2 双重荧光定量PCR 重复性试验结果Table 2 Repeatability test of the duplex qPCR

表3 临床样品检测结果Table 3 Results of clinical sample test

荧光定量PCR 是一种特异性强、敏感性高的核酸定量检测技术。TaqMan 探针法结合了PCR 对核酸的高效扩增、探针技术的高特异性和光谱技术的高敏感性[18-20]，且为完全封闭式反应，降低了假阳性出现的几率。通过比较，本研究建立的方法，敏感性比陈申秒等建立的Hps、Pm、胸膜肺炎放线杆菌多重PCR 检测方法高104个数量级，且选择构建Hps、Pm 的质粒标准品作为模板，较直接提取两种细菌DNA 作为模板稳定性好，检测时间也从3 h 压缩为1 h[21]。与朱新贵等建立的检测Pm 和Hps 双重及多重PCR 方法相比，该方法检测时间更短、敏感性更高、操作更简便[22]。本研究选取了Pm 的保守基因PlpE以及能够特异性区分Hps 毒力株和非毒力株的OmpP2基因，使得该方法能够更准确检测Pm和有效检测未知样品中的Hps 是否具有致病性。此外，设计的探针还能够进一步确保该检测方法的特异性并实时监测试验结果。

由于以两种细菌重组质粒标准品的混合物为模板，再混合两对引物及两条探针，反应的变量增多，优化最适的反应条件则较困难。因此，本研究先分别建立了检测各细菌的单一荧光定量PCR 方法，缩小了需要优化的反应条件。在单一荧光定量PCR 优化的各反应条件基础上，再根据矩阵试验，优化了混合体系的最佳反应条件，使得反应在1 h之内就能完成。敏感性试验显示，双重荧光定量PCR 方法对Hps、Pm 质粒标准品的最低检测限分别为5.60×102拷贝/μL、7.58×102拷贝/μL，与单一荧光定量PCR 检测数量级相同，且比常规PCR 方法敏感性高100 倍，表明检测两种不同菌的特异性引物间干扰较小，双重PCR 体系中的扩增效率几乎未受影响。因此，对基因组拷贝数低、分离困难的菌株也能够尽可能地保证检测的准确性。重复性试验结果显示，组内和组间变异系数均小于2.5 %，重复性和稳定性也均较好，能够缩小不同时间检测的误差。该方法检测临床样本的结果显示，该方法的检出率优于常规PCR，且明显高于细菌的分离鉴定。常规PCR 的敏感性不及荧光定量PCR；细菌分离鉴定虽然是检测细菌最准确的方法，但培养条件的苛刻可能导致假阴性结果，因此双重荧光定量PCR 方法具有更广阔的的应用前景。

总之，本研究建立的双重荧光定量PCR 方法特异性强、敏感性高、重复性好、耗时短，使得其在临床应用上能够在较短的时间排查病原，具有较大的应用价值。