塞内卡病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

王淑娟，王东方，赵月龙，谢彩华，赵雪丽，马震原，王华俊，杨朋霞，闫若潜

(1.河南省动物疫病预防控制中心，河南郑州450008；2.河南科技大学动物科技学院，河南洛阳471003；3.河南农业大学牧医工程学院，河南郑州450002)

塞内卡病毒病是近年来传入我国的一种动物传染病，可以引起猪鼻镜及蹄冠处出现水疱、溃烂创面，偶见发烧及腹泻，出生1 d～3 d 的新生仔猪死亡率可达30 %～70 %[3]，给养猪行业造成重大的经济损失。该病毒病由塞内卡病毒(Senecavirus A，SVA)引起，SVA 属于小RNA 病毒科塞内卡病毒属[1]，其与小RNA 病毒科、心病毒属病毒遗传关系相近[2]。

SVA 感染猪后引起的临床症状与口蹄疫、猪水泡病和水泡性口炎等难以区分，仅凭借临床症状和病理变化给该病诊断带来了一定的困难。因此建立一种快速、特异、敏感检测SVA 的方法势在必行。目前国内外已经建立了多种检测SVA 核酸的方法。Bracht 等建立了SVA 的SYBR Green 荧光定量PCR检测方法，敏感性和重复性较好[3]；Resende 等建立了检测SVA 的原位杂交方法，可以从不同组织中检出SVA，但其检测周期较长[4]；Feronato 等建立了检测SVA 的套式PCR 方法，但其需要两轮PCR 扩增，最后还需电泳检测[5]；樊晓旭等建立了塞尼卡谷病毒TaqMan 荧光定量PCR 检测方法，有较好的特异性和重复性[6]；林彦星等建立了SVA 的反转录重组酶聚合酶常温扩增技术(RT-RPA)快速检测方法[7]。本研究以SVA 的3D 基因为靶标，设计1 对特异性引物和1 条MGB 探针，建立了SVA 荧光定量RT-PCR (FQ-PCR)检测方法，为SVA 提供快速、敏感、特异的临床检测方法。

1 材料与方法

1.1 病毒基因和样品 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR2332 经典株、猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV777 株、猪口蹄疫病毒(FMDV)及SVA cDNA，猪圆环病毒Ⅱ型2b (PCV2b)亚型病毒株、猪伪狂犬病毒(PRV)Bartha-K61 株DNA 均由河南省动物疫病预防控制中心实验室制备保存。28 份疑似SVA 感染病料样品(水泡液拭子、水疱皮、淋巴结等)由河南省动物疫病预防控制中心实验室提供。

1.2 主要实验材料 KingFisher 全自动核酸提取仪购自美国Thermo Fisher 公司；MagMAXTM-96 Viral RNA Isolation Kit 购自美国ABI 公司；ExTaqDNA聚合酶、 Rnase Inhibitor、 DL2000 DNA Marker、DNA 回收试剂盒、质粒小量纯化试剂盒等均购自宝生物工程(大连)有限公司；M-MLV 反转录酶、pGEM-T easy 载体均购自Promega 公司。

1.3 重组质粒标准品的制备 以SVA cDNA 为模板，利用本实验室建立的SVA 常规PCR 方法扩增3D 基因，克隆至pGEM-T Easy 载体中，构建重组质粒，PCR 鉴定为阳性的重组质粒由宝生物工程(大连)有限公司测序。测序正确的重组质粒通过紫外可见光分光光度计测定其OD260nm和OD280nm值，参考Kim 等的方法计算其拷贝数[8]，将其稀释至1.04×108拷贝/μL，于-20 ℃保存备用，作为SVA 重组质粒标准品。

1.4 引物和探针的设计及合成 参照GenBank 登录的SVA 序列(KT321458.1)，应用PrimerExpress 3.0.1 分析软件，分别设计针对SVA 3D 基因的特异性引物(P1： 5'-TGCAYCCCTTYGCTGACT-3'/P2：5'-CCATCTTGCCTGCAGGTACTC-3')和TaqMan 探针(Probe-P3：5'-FAM-CGGTGCCGTACCGAG-MGB-3')，探针5' 端标记为FAM。引物和探针均由Invitrogen公司合成。

1.5 反应条件优化及标准曲线的建立 选择1.04×106拷贝/μL SVA 重组质粒标准品作为模板，P1/P2为引物，采用矩阵法分别对引物浓度(0.05 μmol/L、0.1 μmol/L、0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L)， 探针 Probe-P3 浓度(0.05 μmol/L、0.1 μmol/L、0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L)，退火温度(55 ℃、56 ℃、57 ℃、58 ℃、59 ℃、60 ℃、61 ℃和62 ℃)，体系(20 μL 和25 μL)进行优化。

将SVA 重组质粒标准品10 倍倍比稀释，利用确定的最佳反应体系和条件进行FQ-PCR 扩增，每个浓度重复3 次。以起始模板拷贝数的对数为X轴，Ct 值为Y 轴，建立SVA FQ-PCR 方法的标准曲线。

1.6 特异性试验 按照确定的最佳反应条件，对FMDV、PRRSV、PEDV cDNA，以及PCV2、PRV的总DNA 进行扩增，同时以SVA cDNA 为阳性对照，BHK-21 细胞为阴性对照，评估该方法的特异性。

1.7 敏感性试验 将SVA 重组质粒标准品10 倍倍比稀释(1.04 拷贝/μL～1.04×106拷贝/μL)后，利用本研究建立的FQ-PCR 方法进行检测，同时利用本实验室前期建立的SVA RT-PCR 方法进行检测，评价该方法的敏感性。

1.8 重复性试验 以3 个不同浓度(1.04×104拷贝/μL～1.04×106拷贝/μL)的SVA 重组质粒标准品为模板，每个浓度重复3 次，利用本研究建立的FQ-PCR 方法进行批内重复性试验；同时将该3 个不同浓度的重组质粒标准品分成3 个批次进行FQ-PCR，评估该方法的批间重复性，以验证本研究建立的SVA FQ-PCR 方法的重复性。

1.9 临床样品检测 利用本研究建立的SVA FQ-PCR 方法对28 份临床疑似SVA 感染的样品进行检测，其中，水泡液拭子直接取浸泡上清，水疱皮淋巴结采用组织研磨仪处理后取上清，利用全自动核酸仪提取各处理上清的总RNA，反转录为cDNA，同时以SVA cDNA 为阳性对照。以BHK-21 细胞为阴性对照。FQ-PCR 为阳性的扩增产物由宝生物工程(大连)有限公司纯化及测序，同时与本实验室建立的SVA RT-PCR 方法检测结果和测序结果进行比较分析。

2 结 果

2.1 重组质粒标准品的制备 SVA cNDA 经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，获得460 bp 目的片段，与预期相符(图1)。PCR 产物经纯化回收后构建重组质粒，经测序，结果显示为SVA 3D 基因片段，重组质粒浓度为37.67 ng/μL，经计算其拷贝数为1.04×1010拷贝/μL。

2.2 反应体系与反应条件的优化结果 经优化，P1/P2 引物浓度为0.5 μmol/L，Probe-P3 探针浓度为0.25 μmol/L 时扩增效率较稳定，且最大程度节约成本。反应体系确定为25 μL：10×ExTaq缓冲液2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，P1、P2(20 μmol/L)各0.6 μL，Probe-P3 (20 μmol/L)为0.3 μL，5U/μL ExTaq酶0.25 μL，模板2 μL，补足去离子水至25 μL。最佳反应条件为：94 ℃5 min；94 ℃15 s，60 ℃30 s，40 个循环。阴性对照无特异的扩增曲线，且Ct 值>38.0 或无，阳性对照的Ct 值应≤25.0，且出现特定的扩增曲线，判定检测结果成立。在检测结果成立的前提下，若样品检测结果Ct 值≤35.0，且出现特定的扩增曲线，判定为阳性；Ct 值>38.0 或无，且无特异的扩增曲线，则判定为阴性；35.0

图1 SVA 质粒标准品的PCR 鉴定Fig.1 The identification of SVA stand plasmid by PCR

2.3 标准曲线的建立 利用不同浓度的重组质粒标准品经3 次重复试验所得平均值建立标准曲线结果显示，当质粒标准品在1.04×101拷贝/μL～1.04×106拷贝/μL 范围内，其与Ct 值有很好的线性关系(图2)，所获得相关系数为0.998，斜率为-3.751，截距为41.00，得出拷贝数(X)与Ct 值(Y)之间的线性关系表达式：Y =-3.751×logX+41.00。

图2 SVA FQ-PCR 标准曲线Fig.2 The standard curve for SVA FQ-PCR

2.4 特异性试验 利用本研究建立的方法对SVA cDNA 进行扩增，出现阳性扩增信号，而对FMDV、PRRSV、PEDV、PCV2、PRV 和正常BHK-21 细胞的核酸模板扩增未出现阳性扩增曲线(图3)。表明该方法特异性良好。

图3 SVA FQ-PCR 方法的特异性试验Fig.3 Specificity test for SVA FQ-PCR

2.5 敏感性试验 分别以各个稀释度的重组质粒标准品为模板，进行FQ-PCR 扩增，结果显示对重组质粒标准品的最小检出量为1.04×101拷贝/μL，而常规PCR 最小检出量为1.04×102拷贝/μL (图4)，表明本研究建立的FQ-PCR 方法敏感性较高。

2.6 重复性试验 将不同浓度的重组质粒作为模板进行FQ-PCR 扩增，结果显示批内重复试验变异系数在1.06 %～1.41 %，批间重复试验变异系数在2.85 %～3.66 %。批内及批间变异系数均小于4 %(表1)。表明建立的方法扩增效率稳定，重复性好。

图4 敏感性试验结果Fig.4 The sensitivity tests of the FQ-PCR (A)and the conventional PCR (B)

2.7 临床样品检测 利用建立的SVA FQ-PCR 方法对临床样品进行检测，并与本实验室建立的SVA RT-PCR 检测方法和测序结果进行比较。结果显示，SVA FQ-PCR 检出9 份阳性样品，SVA RT-PCR 检出6 份阳性样品，二者符合率为89.3 %。对9 份阳性PCR 产物测序，序列比对结果显示9 份PCR 阳性产物均为SVA 基因片段，与GenBank 中登录的9株SVA 基因序列同源性均高于97 %。表明本研究建立的SVA FQ-PCR 方法可以用于临床样品的检测。

表1 重复性试验结果Table 1 The results of reproducibility

3 讨 论

SVA 最初命名为塞内卡谷病毒(Seneca Valley virus，SVV)，2015 年国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)批准将种名由“Seneca valley virus，SVV”改为“Senecavirus A，SVA”，其所在的属命名为“塞内卡病毒属(Senecavirus)”[9]。虽然现有资料显示SVA 不具备FMDV 的危害性，且大多数成年猪感染后预后良好，未引起严重的公共卫生后果和经济损失[7]。但SVA 感染的临床症状类似于口蹄疫、猪水泡病和水泡性口炎等其它几种水泡性疾病的病毒感染，给该病的诊断带来困难。

病毒分离是检测病毒最可靠的方法，但该方法操作麻烦，检测周期长。病原核酸检测是实验室诊断最常用的方法，FQ-PCR 技术具有敏感性高、特异性好、操作简单快捷，给检测工作带来很大便利。FQ-PCR 技术分为染料法和探针法两种，Jamnikar 等对染料法和探针法进行了比较，认为探针法用于定量比SYBR Green I 染料法更为准确，且特异性更强[10]。本研究建立的SVA FQ-PCR 检测方法采用了TaqMan MGB 探针，与传统的TaqMan 探针相比，TaqMan MGB 探针缩短了探针的长度，明显提高了探针的Tm 值，也降低了探针的合成成本，TaqMan MGB 探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团，其本身不产生荧光信号，降低了本底信号的强度，使扩增结果更加特异、敏感[11]。

本研究以SVA 的3D 基因保守序列为模板设计引物和探针，并筛选出引物、探针的最佳组合和最优反应体系和反应条件，建立了SVA FQ-PCR 检测方法。该方法检测PCV2、PRV 的DNA 和PRRSV、PEDV、FMDV 的cDNA，结果均为阴性，表明该方法特异性较强。该方法所用的TaqMan MGB 探针，对SVA 重组质粒标准品的最小检出量为1.04 拷贝/μL，樊晓旭等利用TaqMan 探针建立的SVA FQ-PCR 方法可以检出2.8 拷贝/μL 的样品[6]，证实了TaqMan MGB 探针比TaqMan 探针具有更高的敏感性，且敏感性均高于常规PCR 方法。该方法批内及批间变异系数均小于4 %，表明建立的方法扩增效率稳定，重复性好。对28 份临床疑似SVA 感染的样品中检测出了9 份阳性样品，敏感性高于本实验室建立的SVA RT-PCR 方法，且检出的9 份阳性扩增产物经测序后证明确为SVA 3D 基因片段。表明本研究所建立的方法适用于水泡液拭子、水疱皮、淋巴结等不同种类样品的快速检测，为SVA 病的早期诊断及综合防控提供了特异、敏感、快速的方法。