生姜对缺血性脑水肿大鼠脑组织Na+-K+-2Cl-联合转运蛋白1型的影响*

张留超，何雄文，牛美兰

(1.黄河科技学院药理教研室，河南 郑州 450063； 2.河南省中医药研究院附属医院，河南 郑州 450004)

脑水肿是指水在脑组织细胞内外的异常蓄积，是脑缺血损伤后常见的并发症之一，也是致残、致死的重要原因[1]。缺血性脑水肿发生机制尚未完全清楚，是国内外研究热点，其中，Na+-K+-2Cl-联合转运蛋白1型(Na+-K+-2Cl-combined transporter type 1，NKCC1)被认为在缺血性脑水肿中有着关键作用。已有研究证实，大鼠脑缺血模型的星形胶质细胞 NKCC1的转录及表达水平均会显著上调；当予以 NKCC1的特异性抑制剂后其表达下降，并且血-脑屏障损害及神经毒性均会减轻[2-3]。生姜是姜科植物姜 (ZingiberofficinaleRosc.)的新鲜根茎。研究表明，生姜具有较强的抗氧化、清除自由基、抗缺氧和缺血再灌注损伤等作用[4-5]。然而，生姜是否能够通过调控NKCC1的表达水平，减轻缺血性脑水肿症状，从而发挥对大鼠缺血性脑损伤的保护作用尚不明确。本研究通过线栓法构建大鼠大脑中动脉缺血(middle cerebral artery occlusion，MCAO)再灌注模型，通过病理学检测和脑含水量测定，观察生姜对MCAO脑缺血再灌注模型大鼠NKCC1的影响，探讨生姜对大鼠缺血性脑水肿的保护机制。

1 材料与方法

1.1 动 物

SPF级6～8周龄雄性大鼠30只，体质量约210 g，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，质量许可证号为SCXK(苏)2018-0001，以商业饲料为食，在无病原环境中饲养。实验得到郑州大学伦理委员会批准。

1.2 药品、试剂与仪器

生姜购于河南省商丘市夏邑县曹集乡。参照文献方法[6]将其洗净去皮，切碎后按1∶1 (W/V) 加入蒸馏水，榨汁机压榨，用3层纱布过滤后，4 000 r/min 离心15 min，取上清液(生药含量1 g/mL)，避光储存于4 ℃冰箱备用。临用时用蒸馏水分别稀释配成100，200，400 g/L 3种质量分数。兔抗NKCC1抗体(批号YS-17824R)和鼠抗β微管蛋白抗体(批号ANT-019 )，购自艾博抗(上海)贸易有限公司；羊抗兔LgG(H+L)Alexa Fluor 594标记二抗(批号111-585-003)，山羊抗小鼠IgG H&L (IRDye® 680RD)预吸附二抗(批号33218ES60)和羊抗兔IRDye® 680抗体(批号926-68071)，购自武汉三鹰生物技术有限公司。其余试剂均由Sigma-Aldrich公司提供。

1.3 动物分组与给药

将大鼠随机分为假手术组，模型对照组，生姜高、中、低剂量组5组，每组6只。生姜高、中、低剂量组依次给予生姜10，20，40 μL/g，假手术组、模型对照组给予等容积生理盐水10 μL/g。均灌胃给药，1 d 1次，连续 5 d。

1.4 大脑中动脉缺血再灌注模型的建立

末次灌胃 30 min 后，参照线栓法[7]建立模型。将直径为 0.26 mm市售尼龙渔线剪成 6 cm 长，消毒备用。以质量分数 100 g/L 水合氯醛3.5 μL/g 腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定，沿颈正中切开皮肤，钝性分离右侧颈总、颈内、颈外动脉；结扎颈外动脉，夹闭颈总动脉和颈内动脉；自颈总与颈内动脉分岔口上端的颈总动脉上剪口，插入备好的尼龙渔线进入颈内动脉到达大脑中动脉，插入的深度为 20～25 mm，遇到阻力时停止；固定线栓，缝合。造模 2 h后观察大鼠行为。另设假手术组作为对照，制作步骤同手术组，但血管分离后不插线栓。缺血 2 h 后抽出线栓实现再灌注。将造模成功的大鼠随机分为模型对照组，生姜高、中、低剂量组。按造模前给药方法继续给药5 d。

1.5 检测指标

1.5.1 取 材

末次给药后的第10天，进行神经功能评分，然后脱颈椎处死各组大鼠，取脑。每组取3只大鼠的右侧脑组织分装于冻存管中，立即放入液氮冻存，随后放-80 ℃ 冰箱冻存，供Western-Blot 检测使用。另外3只大鼠右侧脑组织采用40 g/L多聚甲醛固定24 h后，常规法进行脱水、透明、石蜡包埋，冠状位切片，供组织病理学检查和免疫荧光法检测。

1.5.2 神经功能评分

根据文献[7]标准进行。无神经系统功能缺损症状、活动正常者计0分，不能完全伸展对侧前爪者计1分，爬行时出现转圈者计2分，行走时身体向偏瘫侧倾倒者计3分，不能自发行走、意识丧失者计4分。

1.5.3 脑组织病理学检查

石蜡切片常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇至ddH2O，苏木素染色4 min，自来水冲洗，1%盐酸乙醇分色2 s，自来水洗后酸化伊红复染2 min，水洗，脱水，透明，封片，显微镜下观察脑组织形态结构的变化。

1.5.4 脑组织含水量

分离右侧大脑半球，称湿重后，再置于80 ℃烤箱中烤至恒重后，称干重，计算脑组织含水量。含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.5.5 NKCC1蛋白

采用Western-Blot法检测NKCC1蛋白。取少量缺血皮质，提取其总蛋白，对蛋白进行定量，常规法进行Western-Blot操作，以Image Studio Lite Ver 4.0分析图像结果。β-Actin为内参计算相对值。每组实验重复3次。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 各组大鼠神经功能评分对比

与假手术组对比，模型对照组大鼠神经功能评分增加，差别有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组对比，生姜高、中剂量组神经功能评分减少，差别有统计学意义(P<0.01)；生姜低剂量组较之差别无统计学意义(P>0.05)。见表1。

组 别n神经功能评分/分假手术组60.00±0.00模型对照组63.04±0.18∗∗∗生姜高剂量组62.56±0.16###生姜中剂量组62.69±0.12###生姜低剂量组62.98±0.21#

注：与假手术组对比，***P<0.01； 与模型对照组对比，#P>0.05， ###P<0.01。

2.2 各组大鼠脑组织病理学检查对比

假手术组大鼠脑组织形态结构完整，神经细胞排列整齐，毛细血管内皮细胞正常、连接紧密、组织致密。模型对照组大鼠脑组织病理改变明显，可见明显的组织水肿，在缺血中心区域可见较多坏死组织，面积大，呈筛网状。生姜各剂量组大鼠脑组织的病理学改变有所改善，其中高、中剂量组改善效果较为明显。见图1。

图1各组大鼠脑组织病理学对比(HE染色，×400)

2.3 各组大鼠脑含水量对比

与假手术组对比，模型对照组大鼠脑组织含水量增加，差别有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组对比，生姜高、中剂量组脑组织含水量均降低，差别有统计学意义(P<0.01或P<0.05)；生姜低剂量组较之差别无统计学意义(P>0.05)。见表2。

组 别n湿重/g干重/g水含量/%假手术组60.665±0.0240.146±0.00478.00±0.51 模型对照组60.716±0.0220.148±0.00679.37±0.33∗∗∗生姜高剂量组60.684±0.0340.149±0.00478.21±0.58###生姜中剂量组60.690±0.0270.148±0.00478.45±0.95##生姜低剂量组60.702±0.0210.147±0.00379.03±0.56#

注：与假手术组对比，***P<0.01；与模型对照组对比， #P>0.05，###P<0.05，###P<0.01。

2.4 各组大鼠脑组织NKCC1Western-Blot法检查对比

与假手术组对比，模型对照组和生姜各剂量组大鼠脑组织NKCC1蛋白表达水平升高，差别有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组对比，生姜各剂量组的NKCC1蛋白表达均降低，差别有统计学意义(P<0.01)。与生姜低剂量组对比，高剂量组的NKCC1蛋白表达降低，差别有统计学意义(P<0.01)，而中剂量组差别无统计学意义(P>0.05)。见表3。

组 别nNKCC1/(g·L-1)假手术组60.250±0.045模型对照组61.022±0.077∗∗∗生姜高剂量组60.544±0.088∗∗∗ ###△△△生姜中剂量组60.753±0.099∗∗∗###△生姜低剂量组60.845±0.107∗∗∗###

注：与假手术组对比，***P<0.01；与模型对照组对比，###P<0.01；与生姜低剂量组对比， △P>0.05，△△△P<0.01。

3 讨 论

生姜具有良好的抗氧化活性，对缺血再灌注氧化应激损伤具有保护作用[2-4]。本研究采用线栓法建立大鼠MCAO再灌注模型[6]，结果模型大鼠均出现对侧前爪不能完全伸展，向对侧倾倒或转圈等神经损伤症状；此外，病理组织学检查结果发现，与假手术组大鼠对比，MCAO再灌注模型大鼠脑组织病理改变明显，表明大鼠神经系统受到损伤，造模成功。与假手术组对比，生姜各剂量组大鼠脑组织病理改变有所减轻，神经功能评分下降，提示生姜可以缓解缺血再灌注所致的神经细胞损伤，具有一定的神经保护功能。模型对照组脑组织含水量明显高于假手术组，生姜高、中剂量给药能够有效降低脑组织含水量，提示生姜能够缓解脑组织水肿症状，这可能是生姜对缺血性脑损伤的保护机制之一。

脑水肿是脑缺血损伤后脑细胞死亡的主要原因之一。脑缺血后由于病理性刺激、离子通道和转运蛋白表达异常[8-9]，细胞内外离子浓度失衡，细胞渗透性改变，细胞发生肿胀，进而引起细胞损伤[10]。NKCC1是中枢神经系统内重要的离子转运蛋白，在脑组织有广泛表达，主要分布在微血管内皮细胞、星形胶质细胞和神经元的细胞膜上，调控Na+-K+-2Cl-的平衡，对维持血脑屏障通透性、保持星形胶质细胞和神经元细胞内正常离子浓度，以及细胞容积的结构基础有重要作用[11]。脑缺血缺氧后，能量代谢障碍加重[12]，活性氧、细胞外高钾和炎症因子等因素均可上调NKCC1，进一步导致Na+内流增多，而水通过渗透压差转移至细胞内。有研究[2-3]发现：大鼠大脑中动脉阻塞后，脑梗死灶周围NKCC1的表达均明显增加，脑水肿加重；抑制NKCC1的表达可以减轻脑梗死面积，同时降低脑缺血造成的脑水肿风险。 生姜可以抗氧化，减轻炎症损伤[14-15]，并能够缓解缺氧和脑缺血再灌注损伤，但是生姜是否能够通过降低NKCC1的表达水平从而缓解缺血性脑水肿尚未见报道。因此本研究通过线栓法建立MCAO再灌注大鼠模型，通过免疫荧光法和Western-Blot法检测，发现：MCAO组大脑组织NKCC1蛋白的表达水平均明显升高，而生姜高、中剂量均能有效降低NKCC1蛋白的表达水平。结合神经功能评分、病理学检查和脑含水量的研究结果，认为生姜可能通过降低NKCC1蛋白的表达水平，减轻脑水肿症状，发挥对缺血性脑损伤的保护作用。

总之， MCAO再灌注大鼠表现出严重的神经功能障碍，脑组织出现明显的梗死灶并伴有脑组织含水量升高，NKCC1蛋白表达水平均明显升高。生姜高、中剂量能明显改善MCAO大鼠神经病学症状，显著缩小脑梗死面积，降低脑组织含水量，降低NKCC1表达水平，提示生姜减轻脑组织水肿和神经损害症状可能与抑制NKCC1的表达有关。