升阳益胃汤对胃癌前病变模型大鼠NF-κB表达及微血管密度的影响*

董晓峰，张 弢，周语平，李雪燕，刘光炜，张 超，陈开兵

(1.甘肃中医药大学中医临床学院，甘肃 兰州 730000； 2.甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730000)

胃癌(gastric carcinoma，GC)是临床上常见的恶性肿瘤之一。早期胃癌的临床症状隐匿性较高、我国胃镜的普查率相对较低等因素使大部分胃癌患者就诊时已处中晚期，而目前尚无针对性的治疗方案，因此，胃癌前病变(precancerous lesions of gastric cancer，PLGC)的治疗成为干预和防治胃癌、降低胃癌死亡率的重要方法和手段。升阳益胃汤出自李东垣的《脾胃论》与《内外伤辨惑论》，由黄芪、半夏、人参、炙甘草、独治、防风、白芍等药物组成，具有益气升阳、清热除湿的作用。核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)[1]是一种具有特定序列的多效转录因子，参与多种炎症、凋亡、免疫过程，在胃癌的发生、发展中扮有重要角色。本课题组前期研究[2-5]证明，升阳益胃汤可以通过调节免疫应答、改善炎症反应等途径达到防治慢性萎缩性胃炎的目的。本实验通过免疫组化法和实时荧光定量PCR检测法观察升阳益胃汤对PLGC模型大鼠NF-κB蛋白与基因表达的影响，采用免疫组化法检测CD34的表达情况检测大鼠MVD值的变化，探讨其防治PLGC的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动 物

SPF级Wistar大鼠96只，雌雄各半，体质量(200±20)g，由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。实验动物合格证号为：SCXK(甘)2015-0001。

1.2 药品、试剂与仪器

升阳益胃汤处方组成：黄芪、半夏、人参、炙甘草片、独活、防风、白芍等。药物均由甘肃中医药大学附属医院中药房提供。维酶素片，0.2 g/片，新乡恒久远药业有限公司产品，批号20170108；盐酸雷尼替丁胶囊，0.15 g/粒，常州兰陵制药有限公司产品，批号20161215；甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)溶液，东京化成工业株式会社产品，批号NH8JH-QD；二甲基亚砜(DMSO)，北京索莱宝有限公司产品，批号521C0318； NF-κB Monoclonal Antibody与Anti-CD34 Rabbit Polyclonal Antibody，均为ImmunoWay公司产品，批号分别为B1101，20161204；荧光定量试剂盒，美国普洛麦格公司产品，批号0000238439；RNA 提取试剂盒，Promega公司产品，批号0000108522。XYJ80-2离心机，东莞市塘厦骏越机电设备厂产品；DF110型电子分析天平，常熟衡器工业公司产品；HH-4数显恒温水浴箱，江苏省金坛市友联仪器研究所产品；S1000TM反转录仪、Benchmark Plus酶联免疫检测仪、CFX96TM Optics Module PCR仪、BIOMATE 3S核酸蛋白测定仪、Chemi DOC XRS+凝胶成像分析系统，均为美国BIO-RAD公司产品；BX51/BX52型显微镜，日本Olympus公司产品。

1.3 药物的配制

以DMSO为溶剂充分溶解MNNG溶液，再加入去离子水配置为质量分数10 g/L的母液，放入 4 ℃冰箱避光保存。成人体质量以70 kg为标准，按照实验动物学大鼠质量折算公式：体质量大鼠日服药量=人日服药量(70 kg)×0.018×5。据此，高剂量组大鼠的灌胃量应为2.66 g/mL，将升阳益胃汤中药煎煮之后浓缩为此质量分数的浓缩液以备使用，中、低剂量药液以去离子水稀释后即得。按上述公式，维酶素悬浮液的质量分数为0.027 g/mL。

1.4 动物分组与模型的建立

将96只大鼠按随机数字表法随机分为正常对照组、模型对照组、维酶素组及升阳益胃汤高、中、低剂量组6组。除正常对照组外，其余各组大鼠避光自由饮用质量分数为150 mg/L的MNNG溶液(以MNNG母液稀释)。将雷尼替丁溶于60 ℃的质量分数为150 g/L浓盐水中配置成质量分数为2.25 g/L的雷尼替丁悬浮液。按大鼠体质量灌胃，灌胃体积为10 μL/g。连续造模6周，通过病理切片来验证PLGC模型复制成功与否。

1.5 给药方法

确认模型复制成功后，维酶素组给予质量分数0.027 g/mL的维酶素悬浮液灌胃，升阳益胃汤高、中、低剂量组分别以质量分数2.66，1.33，0.66 g/mL升阳益胃汤灌胃，均以10 μL/g 体质量灌胃，连续给药45 d。正常对照组和模型对照组不做灌胃处理。

1.6 检测指标

各组大鼠于末次给药后，禁食不禁水24 h；以100 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉，处死；快速取出大鼠胃黏膜组织，以生理盐水冲洗干净，滤纸吸干；一部分胃黏膜组织以多聚甲醛固定以备免疫组化检查，另一部分组织快速放入-80 ℃冰箱冻存以备实时荧光定量PCR检测。

1.6.1 NF-κB、CD34表达

采用免疫组化法检测。对已经用多聚甲醛固定的胃黏膜组织进行常规的石蜡包埋，切片后，在脱蜡二甲苯溶液与不同体积分数的酒精中行脱蜡与水化操作；用柠檬酸钠热修复，并用3%过氧化氢孵育10 min，PBS液冲洗3次；滴加与二抗同源的动物血清进行封闭；按照SP试剂盒说明书所示分别滴加抗体并用DAB显色，直到最终在镜下观察到棕黄色颗粒终止反应；分别进行苏木素复染、梯度酒精、二甲苯透明、封片。各组NF-κB免疫组化切片在40倍镜下随机采10个视野，采用图像分析软件Imagepro Plus 6.0分析棕黄色颗粒的平均光密度值(MOD)；CD34免疫组化切片则在40倍镜下随机取10个视野，用图像分析软件分析单位视野中棕黄色的颗粒得微血管密度(MVD)值。

1.6.2 胃黏膜NF-κB mRNA的表达

采用实时荧光定量PCR检测。先提取胃黏膜组织RNA。胃窦组织总RNA制备方法如下：称取大鼠胃窦黏膜组织50 mg并置于研钵中，加1 mL Trizol研磨均匀后冰上静置 5 min，4 ℃、1 200 r/min离心5 min；移入离心管冰上孵育5 min，加0.2 mL氯仿震荡，4 ℃、1 200 r/min离心15 min，取上清液移至离心管并加0.5 mL异丙醇震荡，冰上孵育10 min，4 ℃、1 200 r/min离心10 min，弃上清液保留RNA沉淀物，向沉淀物中加1 mL体积分数为750 ml/L乙醇，震荡后4 ℃、1 200 r/min离心10 min，再弃上清液后室温静置干燥，加50 μL DEPC处理水溶解RNA。其OD260/OD280均在1.8～2.0 之间，经总RNA琼脂糖凝胶电泳检测符合纯度要求。反转录合成模板cDNA：于0.5 mL去酶管中加入总RNA 5μg、Random Primer 1μL、15×OligodT 1 μL，再加Nuclease-Free Water至10 μL；于70 ℃变性5 min后冰上静置5 min，再按步骤加入反转录各试剂，反应混合物总体积为20 μL，短暂离心后25 ℃温浴5 min，42 ℃反应60 min，再于70 ℃、15 min灭活处理，所得单链cDNA放置于-20 ℃备用。

引物设计：从NCBI基因库中查寻目标基因ID及序列。NF-κB上游引物序列为5′-GGGAAGGAACGCTGTCAGAG-3′，下游引物为5′-TAGCCTCAGGGTACTCCATCA-3′，扩增片段长度为150 bp；β-Actin上游引物序列为5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游引物序列为5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′，扩增长度为150 bp。以上引物均由大连TaKaRa公司设计合成。实时荧光定量PCR以β-actin为内参基因，相同模板相同基因设3复孔、6次平行实验，得到各扩增反应的CT值。反应体系据GoTaq 2-Step RT-qPCR试剂盒说明书配制。反应参数：预变性95 ℃、1 min，变性95 ℃、10 s，退火60 ℃、30 s，循环45次，终末延伸72 ℃、30 s。反应结束后由PCR分析仪采集目的基因(P16、P53)和内参基因(β-Actin)的CT值，并计算△CT=CT目的-CT内参，△△CT=△CT实验组-△CT对照组，最后各组再与对照组间进行2-△△CT计算，得出相对表达量。

1.7 统计学方法

2 结 果

2.1 大鼠脱落情况

造模、判断模型成功，以及给药过程中均有大鼠死亡。最终各组动物数量如下：正常对照组14只，模型对照组10只，维酶素组12只，升阳益胃汤高、中、低剂量组分别为13，12，13只。

2.2 各组大鼠一般情况对比

正常对照组大鼠反应灵敏，饮食、体质量正常，皮毛光泽，精神状态较好，无明显扎堆现象，大便呈颗粒状，垫料异味不明显。模型对照组大鼠饮食减少，体质量增长缓慢，皮毛枯槁，反应迟钝，易受惊吓，扎堆现象明显，大便不成形，垫料异味较重。与模型对照组对比，各药物组大鼠状态有所改善，饮食恢复，精神状态好转，大便恢复至颗粒状。

2.3 各组大鼠胃黏膜MVD对比

与正常对照组大鼠对比，模型对照组大鼠胃黏膜微血管密度值减少，差别有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组大鼠对比，各药物组大鼠胃黏膜微血管密度值升高，差别有统计学意义(P<0.05)。见图1与表1。

图

1

各组大鼠胃黏膜CD34表达对比(免疫组化法，×40)

分组nMVD值/个正常对照组1435.75±2.500模型对照组1012.75±1.708∗维酶素组1219.25±1.258#升阳益胃汤高剂量组1326.75±2.062#升阳益胃汤中剂量组1224.50±3.512#升阳益胃汤低剂量组1315.75±2.500#

注：与正常对照组对比，*P<0.05；与模型对照组对比，#P<0.05。

2.4 各组大鼠胃黏膜NF-κB表达对比

与正常对照组大鼠对比，模型对照组大鼠胃黏膜NF-κB增加，差别有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组大鼠对比，各药物组大鼠胃黏膜NF-κB蛋白表达量降低，差别有统计学意义(P<0.05)。见图2与表2。

图2各组大鼠胃黏膜NF-κB表达对比(免疫组化法，×40)

分组nMOD值正常对照组140.258±0.004模型对照组100.369±0.005∗维酶素组120.322±0.006#升阳益胃汤高剂量组130.274±0.008#升阳益胃汤中剂量组120.300±0.007#升阳益胃汤低剂量组130.261±0.012#

注：与正常对照组对比，*P<0.05；与模型对照组对比，#P<0.05。

2.5 各组大鼠胃黏膜NF-κB mRNA表达对比

与正常对照组对比，模型对照组大鼠胃黏膜NF-κB mRNA表达量升高，差别有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组对比，除升阳益胃汤低剂量组外，其余各药物组大鼠胃黏膜NF-κB mRNA表达量降低，差别有统计学意义(P<0.05)。见表3。

分组nNF-κB正常对照组141.00±0.00模型对照组103.01±0.06∗维酶素组122.59±0.14#升阳益胃汤高剂量组131.09±0.05#升阳益胃汤中剂量组121.25±0.14#升阳益胃汤低剂量组132.95±0.09

注：与正常对照组比，*P<0.05；与模型对照组比，#P<0.05。

3 讨 论

中医学无胃癌前病变这一病名，近代医家根据临床表现将其归属于“痞满”“嘈杂”等范畴。王道坤教授根据正常胃黏膜→浅表性胃炎→萎缩性胃炎→肠上皮化生→不典型增生→胃癌(肠型)的发病过程，将其称为“胃痞重症”。现代医家对于PLGC的病因病机认识各有侧重。导师周语平根据PLGC的临床表现认为其发病多由以脾虚为本、痰湿热毒壅滞所致，临床多以升阳益胃汤加减治疗，并取得了较好的疗效。升阳益胃汤中黄芪补中益气，升阳固表；半夏、人参、甘草片仿大半夏汤通补胃阳，配以防风、白芍、羌活、独活、橘皮、茯苓、泽泻、白术祛风除湿，配以少量柴胡升举阳气，佐以少量黄连厚肠胃燥湿止泄。诸药合用，共奏益气升阳、清热除湿之效。

本研究通过以血管内皮生成因子CD34为标记物进行免疫组化检测，以检测胃黏膜局部毛细血管数量，同时以SP免疫组化法与实时荧光定量PCR法检测了NF-κB基因与蛋白表达水平的变化。结果显示：与正常对照组对比，模型对照组大鼠MVD值显著降低，NF-κB基因与蛋白的表达明显升高，提示以MNNG为基础的复合造模法可能通过介导炎症反应，影响胃黏膜局部的血液循环状态，限制胃黏膜局部营养的供应来源，致使腺体萎缩、细胞结构异型，从而达到复制PLGC模型的目的。与正常对照组对比，各药物组大鼠MVD值均升高，NF-κB蛋白与基因的表达水平均降低，提示升阳益胃汤可以通过改善胃黏膜局部的炎症反应，调节细胞增殖与凋亡失衡，修复胃黏膜局部血液循环状态，改善胃黏膜病理状态，从而达到干预PLGC进展、预防癌变的目的。