白藜芦醇通过TLR4通路对H9C2细胞高糖缺氧/复氧损伤的作用

近年来，研究发现在心肌缺血再灌注(I/R)时，心肌微血管内皮细胞受损引起活性氧物质的生成，导致细胞因子、炎性组织因子等发生脂质过氧化反应，从而引起心肌组织结构和功能障碍[1]。而糖尿病时，机体也可通过多种机制和信号途径促进心肌细胞及其间质纤维化，促进心肌重构[2]。Toll样受体(Toll like receptors，TLRs)是连接先天性免疫与获得性免疫的桥梁，Toll 样受体4 (Toll like receptor 4，TLR4)作为TLRs家族中的一员，已被越来越多的研究证实其在非感染性疾病中具有促进炎症的作用[3]。

白藜芦醇(RES)是一种存在于葡萄、藜芦、虎杖等植物中的多酚类化合物，研究发现白藜芦醇具有抗炎、抗氧化等生物学作用，可抑制由于缺血、缺氧等导致的心肌细胞凋亡，对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用[4-8]。本实验以H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤及高糖处理为模型，旨在从细胞水平探讨白藜芦醇通过TLR4途径对缺氧/复氧诱导和高糖后处理心肌细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1 H9C2细胞培养 H9C2细胞购置于武汉博士德生物公司，使用DMEM完全培养基(10%FBS和1%双抗)，37 ℃，5%CO2，高湿度培养箱培养。

1.2 主要仪器和试剂 DMEM低糖培养基(Hyclone，美国)，二氧化碳培养箱(Thermo，美国)，细胞培养皿(Costar，美国)，低温高速离心机(Thermo，美国)，白藜芦醇(Sigma，美国)，乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒，购自江苏科特生物科技有限公司，CCK8细胞增殖检测试剂盒、AnnexinV/PI细胞凋亡检测试剂盒，购自上海碧云天生物技术有限公司，兔抗鼠TLR4单克隆抗体、辣根过氧物酶标记的羊抗兔 IgG、 兔抗鼠β-actin 单克隆抗体，购自武汉华美生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 实验分组和细胞处理 取生长状态良好的对数生长期细胞，每孔按4×103个接种至96 孔板中，每组设置6个复孔，置于细胞培养箱中培养(37 ℃，5%CO2)，待细胞贴壁后按照分组方案进行相应处理。本研究将细胞分为6组，对照组：心肌细胞按正常培养环境培养，不加任何刺激；缺氧/复氧组：缺氧3 h，复氧2 h，时间开始点为铺板后48 h；缺氧/复氧+RES组：缺氧3 h，复氧2 h，时间开始点为铺板后48 h，复氧开始5 min 后加入药物，一直到2 h；高糖组：高糖浓度为100 mmol/L，处理时间为48 h；高糖+缺氧/复氧组：高糖浓度为100 mmol/L，处理时间为48 h，高糖处理完后，按缺氧/复氧处理，缺氧3 h，复氧2 h；高糖+缺氧/复氧+RES组：高糖浓度为100 mmol/L，处理时间为48 h，按缺氧/复氧处理，缺氧3 h，复氧2 h，白藜芦醇浓度为25μmol/L，在复氧开始5min 后加入，一直到2 h。

1.3.2 CCK8检测细胞增殖 将处理过的细胞继续培养48 h，弃含药培养基，每孔加入新鲜配制的含10 μL 的毒性检测液CCK8，将培养板在培养箱孵育3 h，用酶标仪测波长为450 nm 的吸光度。

1.3.3 AnnexinV/PI检测细胞凋亡率 调整待检测细胞浓度为106个/mL，取200 μL，1 000 r/min离心5 min(4 ℃)；预冷的磷酸盐缓冲溶液(PBS)1 mL润洗两次，1 000 r/min离心5 min(4 ℃)；将细胞重悬于100 μL结合缓冲液，加入2 μL Annexin-V-FITC (20 μg/mL)，轻轻混匀，避光冰上放置15 min；转至流式检测管，加入400 μL磷酸盐缓冲液(PBS)，每个样品临上机前加入1 μL PI (50 μg/mL)，2 min后迅速检测；同时以不加Annexin V-FITC 及PI 的一管作为阴性对照。

1.3.4 ELISA检测细胞上清中LDH、MDA和SOD含量 根据ELISA检测试剂盒说明书测定细胞培养上清中的LDH、MDA 和SOD 含量。

1.3.5 Western-blot法检测TLR4 表达 收集细胞，RIPA裂解细胞，BCA蛋白定量试剂盒定量，统一浓度至100 μg。每孔上样20 μg，电泳，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST洗膜，加入兔抗鼠TLR4 抗体(1∶500)，4 ℃冰箱孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG(1:5 000) 37 ℃ 孵育1 h，漂洗后于ECL成像系统中发光显影，拍照。β-actin做内参。

2 结 果

2.1 不同处理对心肌细胞增殖活力的影响 与对照组相比，缺氧/复氧组、高糖组、缺氧/复氧+高糖组CCK8细胞增殖能力明显下降(P<0.05)，而在加入RES后，缺氧/复氧+RES组、缺氧/复氧+高糖+RES组CCK8细胞增殖能力与缺氧/复氧组、高糖组及缺氧/复氧+高糖组比较有明显提高(P<0.05)。详见表1。

表1 各组CCK8细胞增殖结果(±s)

与对照组比较，1)P<0.05；与缺氧/复氧组、缺氧/复氧+高糖组比较，2)P<0.05

2.2 不同处理对心肌细胞凋亡的影响 与对照组比较，缺氧/复氧组、缺氧/复氧+高糖组细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。加入白藜芦醇后，缺氧/复氧+RES组、缺氧/复氧+高糖+RES组细胞凋亡率较缺氧/复氧组、缺氧/复氧+高糖组明显下降(P<0.05)。高糖组细胞凋亡率与对照组比较有所升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 各组细胞凋亡、LDH、MDA和SOD比较(±s)

与对照组比较，1)P<0.05；与缺氧/复氧组、缺氧/复氧+高糖组比较，2)P<0.05

2.3 各种处理对上清中LDH、MDA和SOD含量的影响 缺氧/复氧组、高糖组、缺氧/复氧+高糖组与对照组比较，LDH、MDA均明显升高(P<0.05)，SOD明显下降(P<0.05)；RES处理后，缺氧/复氧+RES组、缺氧/复氧+高糖+RES组LDH、MDA均较缺氧/复氧组、缺氧/复氧+高糖组明显下降(P<0.05)，SOD较缺氧/复氧组、缺氧/复氧+高糖组明显升高(P<0.05)。详见表2。

2.4 TLR4蛋白的表达(见图1) 缺氧/复氧组、高糖组及缺氧/复氧+高糖组心肌细胞的TLR4蛋白表达量较对照组明显升高，而经过RES处理后，缺氧/复氧+RES组、缺氧/复氧+高糖+RES组TLR4蛋白表达量较缺氧/复氧组及缺氧/复氧+高糖组有所降低，但差异无统计学意义。

A：对照组；B：缺氧/复氧组；C：缺氧/复氧+RES组；D：高糖组；E：缺氧/复氧+高糖组；F：缺氧/复氧+高糖+RES组

图1各组TLR4蛋白的表达

3 讨 论

心肌缺血再灌注损伤是心肌在缺血基础上恢复血流再灌注后，引起细胞功能代谢障碍和结构损伤的现象。糖尿病是一种以高血糖为特征的慢性代谢性疾病。代谢紊乱、心肌纤维化、心肌细胞凋亡、微血管病变、氧化应激、炎症反应、线粒体结构功能改变等都参与糖尿病心肌病的发生发展过程[9]。MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一，具有细胞毒作用，可加剧细胞膜的损伤。LDH存在于心肌细胞的胞浆中，是反映细胞损伤的重要标志物之一。SOD是机体内天然存在的超氧自由基清除因子。本研究结果显示，与对照组相比，缺氧/复氧组及缺氧/复氧+高糖组LDH、MDA及细胞凋亡率升高，SOD降低，心肌细胞增殖受到抑制；高糖组细胞凋亡率无明显变化，LDH、MDA明显升高，SOD明显降低，心肌细胞增殖受到抑制。实验证明，心肌缺血再灌注可通过氧化应激反应促进心肌细胞凋亡、抑制心肌细胞增殖，而高糖处理通过氧化应激反应明显抑制心肌细胞增殖，但心肌细胞凋亡不明显。考虑高糖诱导心肌细胞损伤是一种慢性过程，心肌细胞损伤的程度及机制可能与高糖处理的浓度及时间有关。

越来越多的研究表明，炎症反应在心血管疾病的发生发展中起重要作用[10]。而 TLRs能促进细胞因子的合成与释放，引发炎症反应[11]。TLR4是TLRs 家族的一员，其在识别脂多糖及介导的炎症反应信号转导中发挥了重要作用。TLR4 在部分心血管疾病发生发展过程中起到的作用也成了当前的研究热点。有文献报道心脏TLR4的转录或翻译水平在压力超负荷或高血压所致心脏重构[12]，缺血再灌注或心肌梗死后心脏重构[13]以及糖尿病心脏重构时增多[14]。本研究结果显示，缺氧/复氧处理组和高糖处理组与对照组相比TLR4表达均明显升高，证实了TLR4通路可能参与了糖尿病心肌细胞缺血再灌注的损伤过程。

白藜芦醇具有抗氧化、螯合自由基及抗脂质过氧化等生理药理学作用，能预防及治疗心脏病、动脉粥样硬化、神经退行性疾病。有研究表明，白藜芦醇对缺氧/复氧心肌细胞有保护作用[7-8]。另有研究表明，白藜芦醇可通过负向调控TLR4信号通路减轻高糖环境下牙龈上皮细胞炎症因子的分泌[15]。本研究结果显示，白藜芦醇处理组与缺氧/复氧和高糖处理组相比，TLR4表达有一定程度下降，但作用有限。其原因可能与白藜芦醇处理的浓度和时间有关。另外推测TLR4信号通路也可能只是RES对糖尿病心肌细胞缺血再灌注损伤保护作用的机制之一。

总之，缺氧/复氧和高糖均可通过TLR4表达增加在不同程度上促进心肌细胞的氧化应激及炎症反应，从而加速心肌细胞凋亡，抑制心肌细胞增殖。这一作用可能参与了心肌缺血再灌注损伤和糖尿病心肌病的发病机制。白藜芦醇可能通过降低TLR4表达对糖尿病心肌细胞缺血再灌注损伤具有一定的保护作用，但具体应用的浓度及时间尚待进一步探讨。