积雪草酸抑制去卵巢大鼠骨质疏松的作用

吴少科 陈晓驷 陈海聪 谭小艳 胡资兵 魏波 黄成硕魏劲松 刘田丰

广东医科大学附属医院1骨外科，2VIP病区（广东湛江524023）

骨质疏松症是一种以成骨细胞凋亡加快，破骨细胞增多造成局部骨量大量丢失、骨脆性增加的一种代谢性疾病，同时骨质疏松症患者的骨折风险度增加。近年来骨质疏松症的发病率逐渐增多，有研究报道全球30%的人患有骨质疏松症，其中60岁以上老人骨质疏松症的患病率更严重，发病率达到60%以上，然而女性发病率大于男性［1］。老年人绝经后因其雌激素分泌减少，这导致骨量的大量丢失，同时脊柱、髋骨、手腕等部位较易发生骨折，且发生骨折后难以愈合，更有甚者会引起死亡，给家庭及社会带来沉重的经济负担，因此寻找一种可以有效防治绝经后骨质疏松症的药物已成为当务之急。积雪草酸是一种五环三萜酸，具有广泛的生物学作用。过去积雪草酸主要是用于一些皮肤创伤及慢性溃疡的临床治疗，近来随着对积雪草酸药理活性的研究，发现积雪草酸还具有治疗痴呆症、肿瘤等老年性疾病的作用［2］。有文献［3-4］报道积雪草酸对多发性骨髓瘤细胞的增殖活性具有调节作用，可以防治骨髓瘤的恶化，同时其能抑制骨基质细胞的脂肪分化。那么积雪草酸能否防治老年人绝经后骨质疏松呢？这将是本课题组的研究重点。本课题采用去卵巢大鼠骨质疏松动物模型探讨积雪草酸的抗骨质疏松作用，现具体报告如下。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组42只3个月龄SPF级雌性SD大鼠，由南方医科大学实验动物中心提供，体质量（257±27.1）g，动物合格证：SCXK（粤）2011-0015。适应环境饲养1周后，按体质量对等原则随机分成6组，每组7只，第一组为假手术组，仅切除双侧卵巢附近脂肪组织，且每天给予灌胃生理盐水［3 mL/（kg·d）］；第二组为去卵巢组，行双侧去卵巢手术后每天给予灌胃生理盐水［3 mL/（kg·d），建立骨质疏松模型［5］；第三组为低剂量积雪草酸组，行双侧去卵巢手术后每天给予灌胃积雪草酸［80 mg/（kg·d）］；第四组为中剂量积雪草酸组，行双侧去卵巢手术后每天给予灌胃积雪草酸［100 mg/（kg·d）］；第五组为高剂量积雪草酸组，行双侧去卵巢手术后每天给予灌胃积雪草酸［120 mg/（kg·d）］；第六组为阳性对照雌二醇组，行双侧去卵巢手术后每天皮下注射苯甲酸雌二醇0.02 mg/kg。实验周期为90 d，每周大鼠称重一次，实验结束前12 h禁食，用3%戊巴比妥钠（1.5 mg/kg）行腹腔注射麻醉后右心室彻底抽血分离血清，取右侧股骨置于生理盐水润湿的纱布中，并用锡纸包裹防止水分蒸发，用于指标的检测。

1.2试剂与器材积雪草酸中药材购于东莞国药有限公司，罗盖全购于上海罗氏制药有限公司，低密度脂蛋白、总胆固醇、甘油三酯测试盒购于南京建成公司；RT-qPCR反逆转录试剂盒与SYBR荧光染料购于TaKaRa公司，ALP抗体及内参购于abcam公司，Micro-CT扫描仪（美国Latheta，型号LCT200）、酶标仪（北京普朗医疗，型号DNM-9606）、微量移液器（美国eppendorf，Research Plus系列）、冷冻离心机（美国eppendorf，型号5415R）等常规设备均由本试验室提供。

1.3工作液的制备取积雪草酸中药材500 mg，先用适量二甲基亚砜充分溶解混匀，再用生理盐水稀释、混匀，定容至100 mL，配成浓度为5 mg/mL的积雪草酸工作液，其中二甲基亚砜浓度低于0.1%，常温避光保存。

1.4大鼠血脂水平的检测检测方法按照LDL、TG、TC试剂盒提供的说明书进行操作，样品准备好后用全波长酶标仪测定，并按说明书提供的计算方法得出血清中的血脂水平。

1.5大鼠股骨Micro-CT扫描将处理好的股骨远心端（已截断）标本沿长轴垂直固定于样品固定器内，vivaCT40选择扫描参数：图像矩阵为1024× 1024，整合时间为200 ms，能量/强度为70 kVp、114 μA、8 W。以0°旋转，进行扫描，扫描完成后，选取距生长板远端1.5 mm、层厚3.0 mm的骨组织为松质骨感兴趣区域行三维重组，以最低阈值为170提取图像信息。获得重组图像后，使用Micro CT自带的软件进行定量分析。物理参数分析如下：骨密度、骨体积分数、结构模型指数、骨小梁数量、骨小梁厚度、骨小梁分离度。

1.6大鼠股骨碱性磷酸酶（ALP）的Real-time PCR检测首先取出大鼠股骨约0.6 g，放入预冷的研钵中，同时往研钵中倒入液氮，手持研棒迅速将股骨研至细粉。其次将研制股骨粉末用Trizol进行溶解，提取股骨RNA，再参照RT-qPCR反逆转录试剂盒方法进行RNA转录，最后在SYBR荧光颜料的作用下Real-time PCR扩增仪进行基因相对表达量检测。ALP及β-actin引物序列见表1。

表1 ALP与β-actin引物序列Tab.1 The internal reference sequences of ALP and beta-actin

1.7大鼠股骨DKK1蛋白的Western Blot测定取出大鼠股骨，参照1.6方法进行液氮研磨，其次将股骨研磨粉末用裂解液进行蛋白提取，参照BCA蛋白测定盒检测所提取蛋白的含量，并计算相应的量用于进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，其操作步骤依次为：配胶、灌胶、电泳、转膜、剪膜、封闭、抗体抗原反应、曝光成像、灰度分析。

1.8统计学方法实验数据采用±s表示，对假手术组与去卵巢组之间进行方差分析；去卵巢组与低中高剂量积雪草酸组、去卵巢组与雌二醇组之间进行方差分析；计算比较两组的F值，查阅F界值表，当P＜0.05，表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1大鼠各周体质量变化大鼠各周的体质量变化见表2。与Sham组相比，OVX组大鼠体质量均较低，且在第2、4、6周差异有统计学意义（P＜ 0.05）；与OVX组比较，L-AA组大鼠体质量在前6周内较小，第6周后较大，其中第2、8周差异具有统计学意义，M-AA组大鼠体质量均较大，其中在第3、10周差异具有统计学意义（P＜0.05），H-AA组大鼠体质量在前4周较小，在第4周后则较大，其中在第8、10、12周差异具有统计学意义（P＜0.05），E2组大鼠在实验期间均较大，其中在第10、12周差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组大鼠体重变化Tab.2 Changes of body weight in rats of different groups（n=7） x ± s，g

2.2积雪草酸对大鼠血脂水平的影响各组大鼠低密度脂蛋白、总胆固醇、甘油三酯测量结果见表3。与Sham组相比，OVX组大鼠LDL、TC、TG均增高，其中LDL差异有统计学意义（P＜0.05）；与OVX组比较，L-AA组大鼠LDL、TC、TG均降低，其中LDL、TC差异有统计学意义（P＜0.05），L-AA组大鼠LDL、TC、TG均降低，其中TG差异有统计学意义（P＜0.05），H-AA组大鼠LDL、TC、TG均降低，其中LDL、TG具有统计学差异（P＜0.05），E2组大鼠LDL、TC、TG均降低，其中TG、TC差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3积雪草酸对大鼠股骨骨微结构的影响各组大鼠股骨干骺段模型指数、骨密度、骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁分离度、骨小梁厚度Micro-CT 扫描值见表4，大鼠股骨微结构3D重建见图1。

表3 各组大鼠血脂水平Tab.3 The level of serum lipid in rats of different groups（n=7） x ± s，mmol/L

图1 各组大鼠股骨微结构3D重建图Fig.1 The 3D reconstruction microarchitecture of the femur of different groups

表4 各组大鼠股骨Micro-CT扫描值Tab.4 The result of the femur scanned by Micro-CT in each groups（n=7） x ± s

如表4所示，与Sham组相比，OVX组大鼠SMI、Tb.Sp升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与OVX组相比，L-AA组大鼠BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th升高，SMI、Tb.Sp降低，差异不具有统计学意义，M-AA组大鼠BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th升高，SMI降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），H-AA组大鼠BMD、Tb.N升高差异具有统计学意义（P＜0.05），E2组大鼠SMI降低，BMD、Tb.Th升高，差异具有统计学意义。从图1也可以看出，OVX组大鼠股骨骨丢失严重，Sham、H-AA、E2这3组大鼠骨量丢失不明显（P＜0.05），L-AA、M-AA组则存在少量骨丢失。

2.4 积雪草酸对大鼠股骨ALP表达量的影响从大鼠股骨提取的目的基因，然后进行Real-time PCR检测3次ALP的表达量，检测结果见表5与图2。

表5 各组大鼠股骨ALP的相对表达水平Tab.5 The expression level of rat ALP in each groups

图2 积雪草酸对大鼠股骨ALP表达量的影响Fig.2 Effect of AA on ALP mRNA expression

从图2可以看出，与Sham组相比，OVX组大鼠ALP表达量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与OVX组比较，L-AA组大鼠ALP表达量升高，差异不具有统计学意义（P＜0.05），M-AA组大鼠ALP表达量升高，差异有统计学意义（P＜0.05），H-AA组大鼠ALP表达量升高，差异不具有统计学意义（P＜0.05），E2组大鼠ALP表达量升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.5 积雪草酸对大鼠股骨DKK1蛋白表达量的影响从大鼠股骨提取的目的蛋白，然后进行Westerm Blot检测3次DKK1蛋白的表达量，检测结果见图3。

图3 积雪草酸对大鼠股骨DKK1表达量的影响Fig.3 Effect of AA on DKK1 expression

从图3可以看出，与Sham组相比，OVX组大鼠DKK1表达量升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与OVX组比较，L-AA组大鼠DKK1表达量升高，差异不具有统计学意义（P＜0.05），M-AA组大鼠DKK1表达量升高，差异不具有统计学意义（P＜0.05），H-AA组大鼠DKK1表达量升高，差异不具有统计学意义（P＜0.05），E2组大鼠DKK1表达量升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

绝经后骨质疏松是老年人骨质疏松发生的主要原因，主要表现为骨量减少，骨脆性增加。本实验采用3个月龄大鼠去卵巢进行骨质疏松造模，因为3个月龄大鼠生理状态相当于人类青春期，体质量和生殖器发育已趋稳定，骨形成与骨吸收基本处于平衡状态［6］；另外大鼠骨质疏松模型是一个逐渐形成的过程，去卵巢后大鼠还需经过几个月饲养，骨质疏松症才会形成，在去卵巢后几个月时间里，大鼠骨骺开始封闭，骨代谢变得相对稳定，骨小梁面积百分率下降且密度减少，骨小梁间隙增大等，提示骨质疏松症形成，此时大鼠的生理状态相当于妇女的绝经期。本实验在大鼠骨质疏松形成的过程中开始给药积雪草酸，并且要在骨质疏松形成后与模型组大鼠进行骨质疏松指标检测，饲养90 d后进行指标观察。同时在实验结束后，指标检测发现与假手术组大鼠比较，去卵巢组大鼠体质量明显降低，血清LDL、TC、TG增高，股骨SMI、Tb.Sp指标升高，但BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th指标降低；ALP的表达量降低，ALP作为一种与骨钙化密切相关的蛋白，是骨形成的重要标记，是评估骨形成和骨转化的主要指标，因此提高ALP的活性能够促进成骨细胞的分化，可发挥抗骨质疏松作用，其表达量降低则说明骨细胞的增殖与分化减弱，加速了骨质疏松的形成；低密度脂蛋白受体相关蛋白5（DKK1）表达量升高，有文献报道大鼠去卵巢骨质疏松的形成可能与阻断Wnt传递生长刺激信号相关，在Wnt信号通路中，DKK1是低密度脂蛋白受体相关蛋白5的强抑制剂［7］，可抑制LRP5/LRP6，进而阻止成骨细胞的增殖与分化，导致骨形成功能下降。以上表明去卵巢组大鼠骨质疏松模型形成。

雌激素水平的降低是引起绝经后骨质疏松发生的重要原因。有研究发现在机体骨骼中存在着雌激素和甲状腺激素受体，在正常情况下雌激素可降低骨骼对甲状腺激素的敏感性，减少甲状腺激素对甲状腺激素受体的结合，增加对降钙素的敏感性，促进骨胶原生成、抑制骨吸收，促进骨生成［8］。而去卵巢大鼠由于雌激素水平的较低，促进甲状腺受体与甲状腺激素的结合，破坏了骨形成与骨吸收的动态平衡，造成骨质丢失严重，骨形成减少，导致了大鼠骨质疏松症的形成［9］。同时实验也发现与OVX组大鼠比较，E2组大鼠SMI均降低，BMD、Tb.Th升高，股骨ALP表达量升高，DKK1表达量降低，这与文献报道结果相一致。综上所述雌二醇可以抑制大鼠去卵巢后骨质疏松的形成。

积雪草酸是从药用植物积雪草中提取的三萜酸，属于五环三萜酸类化合物中的乌苏烷型。有报道证实积雪草酸对实体瘤具有显著的增殖抑制作用，如多发性骨髓瘤、乳腺癌细胞、黑色素瘤细胞等。本实验采用积雪草酸提取液进行研究，分为低中高浓度积雪草酸提取液，结果发现3种浓度的积雪草酸提取液均可以提升大鼠股骨的BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、ALP，并减低SMI、Tb.Sp、DKK1。骨质疏松症是一种以单位体积内骨量减少、皮质骨变薄、骨微结构退化、骨生物力学性能降低、骨脆性增加容易致使骨折发生的系统性代谢疾病［10］。积雪草酸可以通过增加骨量来调节去卵巢大鼠骨质疏松症状，其主要是通过调节股骨ALP、DKK1的相对表达量来实现的。同时有研究［4］表明积雪草酸在抗人成骨细胞凋亡方面具有重要作用，正常情况下成骨细胞与破骨细胞是处以一种平衡状态，当成骨细胞大量凋亡或者破骨细胞大量增殖时，机体处以一种骨质疏松骨量丢失的状态，因此减少成骨细胞凋亡也将有利于减缓骨质疏松症。综上所述，积雪草酸可以通过调节ALP、DKK1，降低成骨细胞的凋亡来防治去卵巢大鼠骨质疏松症的发生。去卵巢模拟绝经期可以建立骨质疏松症的动物模型，同时给于积雪草酸能有效地改善大鼠骨质疏松症，其积雪草酸的防治作用与阳性药物雌二醇作用相当。