益气血法中药复方对不同促排卵方案小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响

陈艳婷 王玉林 袁秋虹 邓伟民 郭新宇 陈秀华

1广州中医药大学（广州510405）；2广州中医药大学顺德医院（广东佛山528333）；3中国人民解放军南部战区总医院（广州510010）

不同促排卵方案为体外受精-胚胎移植（IVFET）过程中获取多个卵母细胞创造了可能，促排卵技术成为IVF-ET的关键环节而被广泛应用于临床。临床常用的促排卵技术主要是通过使用大量外源性的促性腺激素以促进卵泡数量增多、体积增大，但容易使机体激素水平过高，导致生殖内分泌出现代谢紊乱。研究发现，促排卵导致的雌激素超过了正常的生理水平，这可能会引起颗粒细胞的大量凋亡［1-2］，影响卵母细胞成熟度与核胞浆成熟的同步性［3］，最终影响卵泡质量。目前现代医学关于促排卵对卵泡质量的影响未找到明确的解决方案，传统中医学对此进行了一系列探索［4-5］，但尚未得到公认的研究成果。前期临床研究发现，中药益气血法可提高IVF的胚胎种植率［6］，进一步动物研究发现益气血法可促进超排卵小鼠卵母细胞分泌因子（OSFs）的表达［7］，OSFs具有维持颗粒细胞低凋亡率的作用，因此，推测益气血法通过促进OSFs的表达以抑制颗粒细胞凋亡从而改善卵泡质量，提高胚胎种植率。为进一步研究益气血法改善卵泡质量的作用机制，本研究通过模拟临床常用的促排卵方案建立小鼠模型，并加以益气血法中药复方进行干预，比较各组小鼠卵巢颗粒细胞关键凋亡因子在中药治疗前后的变化，观察中药复方对不同促排卵方案小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1材料经后增殖方（剂型：颗粒剂，由一方制药有限公司提供，产品批号：Q1708003）。促性腺激素释放激素激动剂（GnRH-a，醋酸曲普瑞林注射液，瑞士辉凌公司，批号：K18565B）；促性腺激素释放激素拮抗剂（GnRH-ant，注射用醋酸西曲瑞克，法国Pierre Fabre公司，批号：H20140476）；注射用血促性素（又名孕马血清促性腺激素，PMSG，以色列prospecbio公司，批号：HOR-272）；人绒毛膜促性腺激素（HCG，丽珠药业有限公司，批号：170704）。

Anti-FAS抗体（1∶1 000，产品批号：ab82419，由英国剑桥Abcam公司提供），Anti-FasL抗体（1∶1 000，产品批号：af 0157，由美国俄亥俄州affnity Biosciences公司提供），Anti-caspase-8抗体（1∶1 000，产品批号：ab25901，由英国剑桥Abcam公司提供），Anti-caspase-3抗体（1∶1 000，产品批号：bs-0081R，由中国北京博奥森生物技术有限公司提供），山羊抗兔IgG抗体（1∶10 000，产品批号：111-035-003，由美国宾夕法尼亚Jackson公司提供），逆转录试剂盒（产品批号：DBI-2220，由德国DBI公司提供），荧光定量PCR试剂盒（产品批号：AOPR-1200，由美国Genecopoeia公司提供），BCA蛋白定量测定试剂盒（产品批号：FD2001，由中国杭州弗德生物科技有限公司提供）。

1.2动物及分组SPF级KM雌性小鼠80只，6～8周龄，体质量20～25 g（来自中国人民解放军南部战区总医院动物实验中心，实验小鼠合格证号：44007200046941）。小鼠均给予自然饮水及饲料喂养1周，1周后按随机数表法随机分为8组，每组10只。各促排卵组分别为：孕马血清促排卵组（PMSG组）、促性腺激素释放激素激动剂促排卵组（GnRH-a组）、促性腺激素释放激素拮抗剂促排卵组（GnRH-ant组）、自然排卵组（空白对照组），共4组；各益气血法中药复方干预组分别在各促排卵方案的基础上给予中药灌胃处理，分别为：PMSG+中药组、GnRH-a+中药组、GnRH-ant+中药组、空白对照+中药组，共4组。

1.3动物干预及处理GnRH-a组：小鼠根据阴道涂片结果确定为动情后期（即为动情周期第3天）时开始造模，具体为：每日9：00 am采用腹腔注射的方式注射20 μg/kg的醋酸曲普瑞林注射液，连续注射9 d，第9天同时腹腔注射PMSG 400 U/kg，于注射PMSG 48 h后腹腔注射HCG 1 000 U/kg。同时给予临床等效剂量的生理盐水灌胃（剂量为1.5 mg/kg），1次/d，连续11 d。GnRH-ant组：GnRH-ant组小鼠以醋酸西曲瑞克注射液400 U/kg代替GnRH-a腹腔注射，其余处理同GnRH-a组。PMSG组：PMSG组小鼠以等体积生理盐水代替GnRH-a腹腔注射，其余处理同GnRH-a组。空白对照组：空白对照组小鼠每日给予等体积生理盐水腹腔注射，连续11 d，灌胃操作同GnRH-a组。GnRH-a+中药组：于GnRH-a组处理的基础上以经后增殖方颗粒剂代替生理盐水灌胃。GnRH-ant+中药组：于GnRH-ant组处理的基础上以经后增殖方颗粒剂代替生理盐水灌胃。PMSG+中药组：于PMSG组处理的基础上以经后增殖方颗粒剂代替生理盐水灌胃。空白对照+中药组：于空白对照组处理的基础上以经后增殖方颗粒剂代替生理盐水灌胃。

上述8组小鼠于最后一次腹腔注射（HCG或生理盐水）2 h后经颈椎脱臼处死，收集小鼠双侧卵巢组织，其中一侧卵巢经4%多聚甲醛固定，另一侧卵巢置于-80℃冰箱冻存。

1.4检测指标与方法

1.4.1qPCR检测各组小鼠卵巢颗粒细胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3 mRNA的表达根据TRIzol试剂盒操作要求从卵巢组织中提取总RNA；将总RNA依照逆转录试剂盒操作要求转化为cDNA；使用荧光定量PCR检测试剂盒进行PCR反应，具体反应条件为：95℃10 min，95℃10 s（40个循环），55 ℃ 20 s，72 ℃ 35 s。用 2-ΔΔCt法计算Fas mRNA、FasL mRNA、caspase-8 mRNA、caspase-3 mRNA的水平。具体引物序列如下：Fas上游引物：5′-GCTGGGCAGATGTCTGATATT-3′；Fas下游引 物 ：5′-CCCAAGACGTGTACTCTTTCTAC-3′；FasL上游引物：5′-CTGTGGCTACCGGTGATATTT-3′；FasL下游引物：5′-GTTCTGCCAGTTCCTTCTGT-3′；caspase-8 上游引物：5′-CTGACTGGCGTGAACTATGA-3′；caspase-8下游引物：5′-CATCAGTTAGGAGGGAAGAAGAG-3′；caspase-3上游引物：5′-CCACGGAATTTGAGTCCTTCT-3′；caspase-3下游引物：5′-CCACTCCCAGTCATTCCTTTAG-3′。

1.4.2Western Blot检测各组小鼠卵巢颗粒细胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3蛋白表达量将各组小鼠卵巢组织悬浮于RIPA裂解液中，根据BCA蛋白定量检测试剂盒操作要求测定总蛋白浓度；转膜，加一抗，4℃过夜，加入二抗，室温下孵育30 min；用ECL法显影曝光。运用Image J 1.8.0分析条带的光密度值（OD）。

1.5统计学方法数据运用SPSS 19.0统计学软件进行分析，对各组小鼠检测到的基因及蛋白数据以均数±标准差表示，所有数据均符合正态分布且方差齐，中药治疗前后的两组小鼠基因及蛋白的水平比较采用t检验，多个组别间小鼠基因及蛋白的水平比较用方差分析，组间的多重比较采用LSD分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组小鼠卵巢颗粒细胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3 mRNA相对表达水平各组小鼠经不同促排卵方案处理后，颗粒细胞凋亡因子Fas、FasL、caspase-8、caspase-3 mRNA表达水平由高到低分别为：GnRH-a组/GnRH-ant组＞空白对照组＞PMSG组。其中，GnRH-a组小鼠卵巢颗粒细胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3 mRNA表达水平显著高于空白对照组（均P＜0.01）；GnRH-ant组小鼠卵巢颗粒细胞FasL、caspase-8 mRNA表达水平显著高于空白对照组（均P＜0.01），Fas、caspase-3 mRNA表达水平与空白对照组相比差异无统计学意义（P=0.85，P=0.51）；PMSG组小鼠卵巢颗粒细胞凋亡因子Fas、caspase-8、caspase-3 mRNA表达水平显著低于空白对照组（均P＜0.01），FasL mRNA表达水平虽低于空白对照组，但差异无统计学意义（P=0.64）。

中药干预后，各组小鼠颗粒细胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3 mRNA表达水平均降低。其中，PMSG+中药组较PMSG组小鼠颗粒细胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3 mRNA表达水平均显著降低（P=0.01，P＜ 0.01，P=0.03，P＜ 0.01）；GnRH-a+中药组、GnRH-ant+中药组分别较GnRH-a组、GnRH-ant组小鼠颗粒细胞 Fas、FasL、caspase-8、caspase-3 mRNA表达水平均显著降低（均P＜0.01）；空白对照 +中药组Fas、FasL、caspase-8 mRNA表达水平较空白对照组明显降低（均P＜0.01），caspase-3 mRNA水平也较空白对照组降低，但差异无统计学意义（P=0.13）。见表1。

2.2各组小鼠卵巢颗粒细胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3蛋白相对表达量各组小鼠经不同促排卵方案处理后，颗粒细胞凋亡因子Fas、FasL、caspase-8、caspase-3蛋白相对表达量由高到低分别为：GnRH-a组/GnRH-ant组＞空白对照组＞PMSG组。其中，GnRH-a组和GnRH-ant组小鼠卵巢颗粒细胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3蛋白相对表达量显著高于空白对照组（均P＜0.05）；PMSG组小鼠卵巢颗粒细胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3蛋白相对表达量虽低于空白对照组，但差异无统计学意义（P=0.62，P=0.87，P=0.48，P=0.45）。

表1 各组小鼠颗粒细胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3 mRNA相对表达水平Tab.1 Expression levels of Fas，FasL，caspase-8，caspase-3 mRNA in granulosa cells of mice ±s

表1 各组小鼠颗粒细胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3 mRNA相对表达水平Tab.1 Expression levels of Fas，FasL，caspase-8，caspase-3 mRNA in granulosa cells of mice ±s

注：与空白对照组比较，##P＜0.01；PMSG组vs.PMSG+中药组，aP＜0.05，aaP＜0.01；GnRH-a组vs.GnRH-a+中药组，bbP＜0.01；GnRH-ant组vs.GnRH-ant+中药组，ccP＜0.01；空白对照组vs.空白对照+中药组，dP＜0.05，ddP＜0.01

组别PMSG组GnRH-a组GnRH-ant组空白对照组中药干预后PMSG+中药组GnRH-a+中药组GnRH-ant+中药组空白对照+中药组Fas 0.18±0.07##0.99±0.25##0.45±0.15 0.44±0.18 0.11±0.05a 0.18±0.07bb 0.07±0.03cc 0.23±0.07d FasL 0.15±0.05 0.90±0.29##1.25±0.40##0.21±0.07 0.08±0.02aa 0.45±0.10bb 0.27±0.04cc 0.10±0.02dd caspase-8 0.76±0.26##1.45±0.24##1.45±0.18##1.11±0.15 0.52±0.17a 0.42±0.12bb 0.34±0.08cc 0.30±0.10dd caspase-3 0.65±0.19##5.48±1.65##2.86±0.82 2.55±0.67 0.35±0.15aa 1.55±0.44bb 0.20±0.06cc 2.00±0.78

中药干预后，各组小鼠颗粒细胞中Fas、FasL、caspase-8、caspase-3蛋白相对表达量均降低。其中，PMSG+中药组较PMSG组小鼠颗粒细胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3蛋白相对表达量均显著降低（P=0.03，P=0.04，P＜ 0.01，P=0.04）；GnRH-a+中药组较GnRH-a组小鼠颗粒细胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3蛋白相对表达量均显著降低（P＜ 0.01，P=0.02，P＜ 0.01，P＜ 0.01）；GnRH-ant+中药组较GnRH-ant组小鼠颗粒细胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3 蛋白相对表达量均显著降低（P=0.01，P=0.01，P＜ 0.01，P=0.04）；空白对照+中药组Fas、caspase-8蛋白相对表达量较空白对照组明显降低（均P＜0.01），FasL、caspase-3蛋白相对表达量虽低于空白对照组，但差异无统计学意义（P=0.30，P=0.35）。见表2、图1。

表2 各组小鼠颗粒细胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3蛋白相对表达量Tab.2 Relative expression of Fas，FasL，caspase-8，caspase-3 protein in granulosa cells of mice ±s

表2 各组小鼠颗粒细胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3蛋白相对表达量Tab.2 Relative expression of Fas，FasL，caspase-8，caspase-3 protein in granulosa cells of mice ±s

注：与空白对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；PMSG组vs.PMSG+中药组，aP＜0.05，aaP＜0.01；GnRH-a组vs.GnRH-a+中药组，bP＜0.05，bbP＜0.01；GnRH-ant组vs.GnRH-ant+中药组，cP＜0.05，ccP＜0.01；空白对照组vs.空白对照 +中药组，ddP ＜0.01

组别PMSG组GnRH-a组GnRH-ant组空白对照组中药干预后PMSG+中药组GnRH-a+中药组GnRH-ant+中药组空白对照+中药组Fas/β-actin 0.47±0.05 0.70±0.06##0.76±0.12##0.50±0.02 0.36±0.04a 0.31±0.03bb 0.51±0.04c 0.31±0.05dd FasL/β-actin 0.48±0.05 0.79±0.06#0.72±0.05#0.50±0.22 0.40±0.02a 0.58±0.07b 0.48±0.09c 0.33±0.10 caspase-8/β-actin 0.50±0.03 0.78±0.10##0.86±0.09##0.54±0.07 0.29±0.06aa 0.38±0.05bb 0.42±0.09cc 0.25±0.04dd caspase-3/β-actin 0.38±0.04 0.79±0.05##0.70±0.12##0.43±0.05 0.31±0.03a 0.51±0.02bb 0.47±0.05c 0.38±0.06

图1 各组小鼠颗粒细胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3蛋白相对表达量Fig.1 Relative expression of Fas，FasL，caspase-8，caspase-3 protein in granulosa cells of mice

3 讨论

促排卵方案主要是通过使用超出生理剂量的人为激素使卵巢的功能得到增强，促进多个卵子同时发育，进而为提高IVF-ET的胚胎种植率及临床妊娠率提供更多的可能。但促排周期获得的卵泡与自然排卵周期获得的卵泡，不同状态下卵泡质量是否有差别，是值得思考的问题。卵泡作为卵巢的基本功能单位而存在，其发生发育与颗粒细胞的增殖分化关系密切。卵泡的生长依赖于卵泡刺激素（FSH）和促黄体生成素（LH）的共同作用，而颗粒细胞上含有FSH和LH的受体，因此颗粒细胞的发育能力直接影响卵泡的发育和闭锁。颗粒细胞可通过各种途径分泌雌二醇和类胰岛素样生长因子等，而这些因子是卵泡发育成熟不可或缺的，若这些主要营养因子出现缺失，则颗粒细胞丧失其功能并发生凋亡，相应地影响卵泡的功能［8］。研究［9-10］发现，颗粒细胞的过度凋亡会使得卵母细胞质量下降，进而卵泡的生长发育过程发生变化，最终影响胚胎的发育潜能及及其质量。研究［11-14］表明，细胞凋亡是卵泡闭锁的根本机制。细胞凋亡机制非常复杂，Fas通路是经典细胞凋亡通路之一，哺乳动物卵巢颗粒细胞凋亡的关键通路之一就是由Fas介导的凋亡信号通路引发的［15-17］，该通路涉及的主要凋亡因子有4个，分别为Fas、FasL、caspase-8、caspase-3，该路径的活化是细胞发生不可逆凋亡的重要标志。

目前常用的促排卵方案主要有：GnRH-a方案、GnRH-ant方案、PMSG方案。研究［18-19］表明，GnRH-a方案与GnRH-ant方案均可导致大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的发生。临床研究［20］发现，卵巢储备功能正常的妇女给予GnRH-a与GnRH-ant两种不用的促排卵方案，其颗粒细胞的凋亡率是相当的，两组间凋亡率差异无统计学意义。本研究中，经GnRH-a与GnRH-ant方案干预后，小鼠卵巢颗粒细胞4个关键凋亡因子Fas、FasL、caspase-8、caspase-3 mRNA及其蛋白的表达较空白对照组均升高，表明GnRH-a方案与GnRH-ant方案可导致小鼠卵巢颗粒细胞的凋亡。PMSG具有FSH和LH两种生物活性，于月经周期的卵泡期使用人为的FSH可抑制卵泡细胞发生凋亡现象，并且可促进卵子的蛋白质合成［21］，有利于卵泡发育成熟，进而可增强卵母细胞生长发育的能力［22］。研究表明［23］，PMSG具有抑制卵泡闭锁以及颗粒细胞凋亡的作用。本研究中PMSG组小鼠卵巢颗粒细胞Fas、FasL、caspase-8、caspase-3 mRNA及其蛋白表达较空白对照组降低，表明PMSG方案可抑制颗粒细胞的凋亡，与以上研究结果基本一致。

中医认为：“女子以血为本，以气为用”。由此可见，气血对女性生理病理的重要性。肾蕴藏生殖之精，而精与血有着同源且互相滋生的关系，二者是月经来潮的重要条件。精又可生气，机体肾精所化之气为“肾气”，肾中精气充盛，精血充盈，月经来潮，具备生育的基本条件。因此，本研究提出从益气血兼补肾的角度治疗妇科疾病。益气血法主方为经后增殖方，全方以四君子汤加四物汤组成补益气血的主药，另加菟丝子、山萸肉，两味药物均可滋阴补肾，加以具有温肾助阳功效的杜仲、鹿角胶、蜀椒，达到阳中求阴的功效。使药为炙甘草，具有调和药性的功效，并且与以上药物合用取其甘温生阳的效果。以上药物配伍使用，使全方具有气血俱补的功效，经后增殖方可促进机体气旺血盛，冲任二脉得以滋养，阴阳达到调和的状态，为摄精受孕准备了良好的条件。经后增殖方用于月经周期中的经后期，全方气血俱补，对卵子质量及临床妊娠率的提高有较好的疗效。本研究中，益气血法主方经后增殖方干预后，各组小鼠卵巢颗粒细胞中 Fas、FasL、caspase-8、caspase-3 mRNA及其蛋白的表达均下降，其中PMSG+中药组、GnRH-a+中药组与GnRH-ant+中药组较PMSG组、GnRH-a组与GnRH-ant组各凋亡因子基因及其蛋白表达水平显著降低，说明中药经后增殖方可对临床常用的促排卵方案导致的卵巢颗粒细胞的凋亡均有一定的遏制作用，并且服用中药经后增殖方有助于改善小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的情况，使其达到或接近正常排卵状态。同时，益气血法主方经后增殖方对自然排卵小鼠的颗粒细胞凋亡也有明显的抑制作用，表明益气血法中药复方不仅可抑制促排卵小鼠卵巢颗粒细胞的凋亡，对正常排卵小鼠也具有抑制凋亡的作用。

综上所述，益气血法中药复方可下调不同促排卵方案小鼠卵巢颗粒细胞凋亡因子Fas、FasL、caspase-8、caspase-3 mRNA及蛋白的表达，改善不同促排卵方案小鼠卵巢颗粒细胞的凋亡状态。前期研究［24］表明，益气血法主方经后增殖方可促进超排卵大鼠卵母细胞分泌因子GDF9与BMP15的表达，GDF9与BMP15具有维持卵巢颗粒细胞低凋亡率的作用。因此，推测益气血法可能是通过提高GDF9与BMP15的表达，抑制颗粒细胞的凋亡，达到改善卵母细胞质量的作用。本研究中益气血法主方经后增殖方为中药复方，药物组成较多，起主导作用的中药成分目前尚未进行筛选研究，有待将来进一步深入研究。