丹参酮ⅡA通过Nrf2调节ALDOC减轻海马神经元放射性损伤的机制

任陈 李璐 徐艳侠 杜莎莎

南方医科大学南方医院放疗科（广州 510515）

放射治疗是目前头颈部肿瘤及中枢神经系统肿瘤的重要治疗手段之一，患者在这一治疗过程中不可避免地会出现放射性神经损伤。随着诊疗手段的不断进步及药物研发水平的日益提高，肿瘤患者的预后及生存时间有了明显改善，其海马区域在放射治疗过程中受到不同程度的照射，出现放射性神经损伤并导致生存质量下降［1-5］，这一现象得到了越来越多的关注［6-8］。如何减少放疗患者的放射性神经损伤，成为了一个重要的临床问题。

前期研究提示，丹参酮ⅡA（tanshinoneⅡA）可能通过调节糖酵解及自噬减轻海马神经元放射性损伤［9］，且在动物试验中也发现，其对经放射线照射后的豚鼠内耳毛细胞、血管纹及螺旋神经节均起到一定程度的保护作用［10］，但这一作用的具体机制尚不清楚。本文在前期研究的基础上，发现糖酵解酶ALDOC在放射线联合丹参酮ⅡA处理的神经元细胞中出现表达改变，并进一步研究相关调节通路，探索丹参酮ⅡA通过调节糖酵解减轻海马神经元放射性损伤的分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞照射试验分单纯对照组（Control）；单纯药物组（Tan）；照射组（RT）；照射+丹参酮ⅡA处理组（RT+Tan）。采用本单位Varian 23EX直线加速器处理细胞，分别给予单次照射6 MV X射线，源皮距100 cm。

1.2荧光定量PCR检测mRNA表达利用Trizol法提取各组细胞的总RNA，反转录试剂盒进行反转录（步骤主要参考TaKaRa反转录试剂盒说明书），实时荧光定量PCR检测各组细胞Nrf2、ALDOC的mRNA表达水平。

1.3Western Blot检测蛋白的表达水平在对数生长期收集细胞，D-hanks洗涤后加入RIPA裂解液裂解细胞，BSA法检测蛋白浓度（方法同BSA试剂盒说明书），Western Blot检测各组细胞糖酵解相关蛋白ALDOC、LDHA、Glut1，细胞自噬相关蛋白LC3、P62表达水平，以β-actin为内参。

1.4慢病毒系统构建ALDOC稳定高表达及低表达HT-22细胞购买ALDOC过表达及干扰表达病毒液（上海吉凯公司），按照公司慢病毒感染说明书感染HT-22细胞，经G418处理后筛选出ALDOC过表达及沉默组细胞，分别为：LV-ALDOC，sh-ALDOC。

1.5MTT法检测细胞活力在96孔板中分别接种 LV-Control、LV-ALDOC、sh-Control、sh-ALDOC，每种细胞设置3个复孔，细胞密度约5×103个/孔，细胞贴壁24 h后按照1.1方法照射，照射剂量为 10 Gy，继续培养 48 h，每孔加入20 μL MTT 溶液（5 mg/mL），4 h后小心吸去孔内培养液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490 nm处测量各孔的吸光值，分析各组细胞活力。

1.6流式细胞术检测细胞凋亡6孔板中分别接种 LV-Control、LV-ALDOC、sh-Control、sh-ALDOC，细胞贴壁24 h后按照1.1方法照射，照射剂量为10 Gy，继续培养 48 h，胰酶（EDTA Free）消化细胞，PE-Annexin-V/7-AAD双染细胞，流式细胞仪检测各组凋亡细胞比例。

1.7质粒转染干扰Nrf2的表达培养HT-22细胞，转染前1天细胞传代至6孔板，细胞密度70%～80%，1 d后按照LipofectamineTM2000说明书转染si-Nrf2、si-nc质粒（上海吉凯公司），48 h后收集细胞按照1.2、1.3方法提取RNA和蛋白质。

1.8免疫荧光检测Nrf2的表达丹参酮ⅡA联合放射线照射HT-22细胞后免疫荧光法检测其Nrf2的表达。

1.9统计学方法使用SPSS 19.0统计软件，计量资料数据均以均数±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用Bonferroni法（方差齐性），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1丹参酮ⅡA促进海马神经元细胞株糖酵解相关酶ALDOC的表达对海马神经元HT-22细胞加或不加丹参酮ⅡA处理，并予以放射线照射。相对于RT组，RT+Tan组HT-22细胞的糖酵解相关酶ALDOC在mRNA水平（F=97.488，P＜0.05，组内比较：RT vs.RT+Tan，P ＜ 0.05；图1A）及蛋白水平（图1B）表达明显上调（P＜0.05）。

2.2ALDOC促进糖酵解及自噬调节海马神经元放射性损伤利用慢病毒系统建立稳定过表达ALDOC及稳定沉默ALDOC细胞株。射线照射后分别检测HT-22细胞的活力、细胞凋亡比例情况。结果显示，ALDOC能显著提高射线照射后海马神经元HT-22细胞的存活率（F=126.13，P＜0.05）（图2A），同时降低其凋亡比例（F=98.677，P＜0.05）（图2B）。反之，稳定干扰ALDOC能明显抑制射线照射后HT-22细胞的细胞存活率（图2A）。进一步检测海马神经元细胞HT-22的糖酵解及自噬水平，可见，ALDOC能增加经射线照射后的HT-22细胞糖酵解，且促进自噬相关蛋白的表达（图2C）。

图1 丹参酮ⅡA处理后海马神经元HT-22细胞ALDOC表达情况Fig.1 ALDOC expression in hippocampal neurons HT-22 cells treated with tanshinoneⅡA

2.3丹参酮ⅡA通过Nrf2调控ALDOC的表达为进一步探讨丹参酮ⅡA调节ALDOC的分子机制，利用PROMO、QIAGEN软件分析与ALDOC启动子区结合的转录因子，取二者交集，与文献报道丹参酮ⅡA刺激后上调的转录因子再次做交集，发现Nrf2是ALDOC潜在的转录因子。经丹参酮ⅡA处理后，可见Nrf2及ALDOC在mRNA水平及蛋白水平表达均有明显上调（P＜0.05）；随后干扰Nrf2，ALDOC则随之受到抑制（P ＜0.05，图3A、3B）。且通过免疫荧光检测发现，丹参酮ⅡA处理HT-22细胞后，能上调Nrf2表达，并使Nrf2从细胞浆转移至细胞核（图3C）。

图2 ALDOC对海马神经元HT-22细胞的放射性损伤的作用Fig.2 Effect of ALDOC on radioactive damage of hippocampal neurons HT-22 cells

3 讨论

本课题组在既往工作中发现，ALDOC可能在丹参酮ⅡA减轻海马神经元放射性损伤过程中起到了关键的作用。ALDO是糖酵解过程中的一个重要的酶，对糖酵解的第4步这一可逆性的过程起到了催化作用。其家族有3个成员：ALDOA主要在肌肉中高表达，ALDOB常常在肝脏组织中发现，而ALDOC主要在脑海马神经元及浦肯野神经元中表达［11］。有研究［12］表明ALDOC能与Wnt/βcatenin信号通路相互作用，从而影响细胞分化、大脑海马回的发育等。当对丹参酮ⅡA处理后的海马神经元HT-22细胞进行照射后，细胞的糖酵解相关酶以及自噬上调，生存分数较RT组明显上升、凋亡减少，考虑丹参酮ⅡA可能通过诱导糖酵解及自噬而对海马神经元起到保护作用，这一作用也在之前的研究中得到证实［9］。在这一过程中ALDOC也出现了明显的表达上调。单纯上调ALDOC也能明显促进糖酵解相关酶和自噬的表达，细胞存活增加。而抑制丹参酮ⅡA处理后细胞的ALDOC，HT-22细胞在放射线照射后细胞凋亡比例较前增加，细胞糖酵解及自噬均明显下降。表明丹参酮ⅡA可能是通过调节ALDOC的表达来保护海马神经元放射性损伤。

Nrf2是机体内一个重要的内源性抗氧化因子，在细胞氧化还原稳态、细胞生长和凋亡、炎症反应以及泛素介导的降解等方面均有一定的作用。既往研究发现，丹参酮能通过激活Nrf2，进一步活化其下游的细胞保护性因子GSH、SOD等，而拮抗神经毒素6-hydroxydopamine（6-OHDA）对SHSY5Y细胞线粒体的损伤，从而缓解帕金森病的进展［13-14］，在神经保护方面有着显著作用。本研究发现，丹参酮ⅡA能促进Nrf2的表达，同时促进其从胞浆到胞核的转移，而生物信息学分析发现，Nrf2作为重要转录因子与ALDOC的启动子区结合，这可能是丹参酮ⅡA通过调控ALDOC的表达调节海马神经元细胞放射性损伤的分子通路之一。

图3 丹参酮ⅡA通过Nrf2促进ALDOC表达Fig.3 TanshinoneⅡA promotes ALDOC expression through Nrf2

自噬能产生降解产物，为生物合成提供底物，为细胞提供能量，具有重要的细胞代谢调节能力。当放射治疗导致细胞能量供应缺乏时，为了维持细胞稳态和细胞器的更新，给饥饿状态下的细胞提供代谢底物以维持生存，包括神经元在内的大多数真核细胞能发生自噬［15-17］。大量信号通路与mTORC1相互作用，从而诱导自噬来抑制细胞生长并减少能量消耗，对抗应激状态并存活［18-20］。自噬还能清除体内过多的过氧化物酶，防止其造成组织损伤，是生存的重要保守功能。丹参酮ⅡA则正可能是通过促进放射线照射的海马神经元细胞糖酵解及自噬的增加，一方面减少能量消耗，另一方面通过糖酵解提供适量的能量，从而保障细胞的基本生长需求，起到放射性损伤的保护作用。

丹参酮ⅡA可能通过多种分子信号通路影响海马神经元的存活，本研究仅在体外试验细胞层面上初步探索了该药物可能通过Nrf2调节糖酵解酶ALDOC从而引起糖酵解及自噬的改变，促进海马神经元HT-22细胞对放射性损伤的耐受的相关机制，其在临床治疗过程中的应用尚有待于进一步探索。