柴枳半夏汤加减对结核性胸膜炎治疗前后胸膜厚度及炎症因子的影响

潘静洁 黄晋 刘堂营

广州市胸科医院中医科（广州510095）

结核性胸膜炎（tuberculous pleuritis）属于肺外结核病，是结核杆菌及其自溶产物或代谢产物首次侵入机体的胸腔膜所引起的胸膜炎症，2000年已经被我国卫生部批准的新分类法归纳为结核病的第四类型［1-2］。一般在临床上，结核性胸膜炎容易导致炎症细胞浸润，从而促使血管通透性增高，随后发生纤维化、浆液渗出增加进而引起胸水，然后胸腔积液会在不同的细胞因子刺激下，进一步引发肺纤维化，最终严重影响肺组织的正常功能，引起胸膜炎的临床症状［2-4］。《金匮要略·痰饮咳嗽病脉证并治》：“饮后水流在胁下，咳唾引痛，谓之悬饮。”证见胁下胀满，咳嗽或唾涎时两胁引痛，甚则转身及呼吸均牵引作痛，心下痞硬胀满，或兼干呕、短气，头痛目眩，或胸背掣痛不得息，因此在中医的理论划分中，结核性胸膜炎属于“悬饮”范畴［5］。而柴枳半夏汤出自《医学入门》，能和解少阳，清热宣肺，柴胡、黄芩和解少阳，瓜蒌、半夏、枳壳宽胸祛痰利气，青皮、赤芍理气止痛，桔梗、杏仁宣肺止咳，对悬饮初期出现的胸胁闷痛等具有良好的临床疗效，其中柴胡、枳壳、桔梗也被广泛认为具有良好的抗纤维作用［6-7］。柴枳半夏汤还能调畅中焦气机，《难经·二十二难》曰：“气主呴之，血主濡之”。气行则血行，治血先治气。而近年来，越来越多研究发现，胸腔积液中有许多成分，其中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素-γ（IFN-γ）与胸膜厚度和炎症反应的变化具有密切关系［7-9］，转化生长因子-β1（TGF-β1）则是纤维化过程中非常关键的细胞因子［10］。因此，基于我院科室利用柴枳半夏汤加减联合抗结核药及胸腔穿刺引流术治疗结核性胸膜炎取得良好疗效的临床基础上，观察治疗前后胸膜厚度、胸腔积液消失时间以及采用RT-PCR检测胸水中TGF-β1、TNF-α、IFN-γ mRNA水平的变化，以期揭示柴枳半夏汤加减治疗结核性胸膜炎的作用机制，为柴枳半夏汤的临床应用提供一定的科学理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料选取2018年3月1日至2019年2月28日在我科住院接受诊治的结核性胸膜炎病人80例，按照随机数字法随机分为联合组和对照组，每组40例。本研究中所有患者均已签署我院的知情同意书，患者本人及其家属均对研究的方法和临床意义知情并且同意配合开展，且本研究已获得我院伦理委员会的批准同意。其中联合组中男22例，女18例，平均年龄为（54.6±19.1）岁，病程（25.4±5.2）d，体质量指数（BMI）为（22.9±2.2）kg/m2，而对照组中男 19例，女21例，平均年龄为（50.3±18.5）岁，病程（29.3±7.5）d，BMI为（23.2±2.8）kg/m2，经统计分析后发现，两组患者在性别比、BMI、病程长短和年龄等一般资料相比差异并无统计学意义（P＞0.05），资料具有可比性。

1.2诊断标准按照2017版《WS288-2017肺结核诊断》中对于结核性胸膜炎的诊断标准制定。（1）临床诊断：PPD试验呈现阳性者（硬结平均直径≥10 mm）；IGRAS检测阳性结果；结核抗体阳性者；影像所见为渗出性胸腔积液，表现为少量或中大量的游离积液，或存在于胸腔任何部位的局限积液，胸水常规、生化表现为渗出液。（2）确诊病例：涂片显微镜检查阳性；分枝杆菌培养阳性，鉴定为结核分枝杆菌复合群；结核分枝杆菌核酸检测阳性；胸腔积液或胸膜病理学检查表现为上皮细胞样肉芽肿性炎，显微镜下可见坏死性和非坏死性肉芽肿，PCR检测阳性。

1.3纳入标准及排除标准纳入标准：同时符合诊断标准和剔除标准的患者。排除标准：（1）年龄＞75岁或＜18岁的患者；（2）其他疾病原因引起胸腔积液的患者；（3）近期曾进行抗结核治疗的患者；（4）合并严重脏器功能衰竭不宜服用中药的患者；（5）主客观不配合治疗的患者；（6）未签署知情同意书的患者。

1.4治疗方法对照组：入院后常规胸部彩色多普勒超声检查及胸腔积液定位，盐酸利多卡因（国药准字H37022839，山东华鲁制药有限公司）局部浸润麻醉，胸腔穿刺引出胸水进行检查，首日引出量≤600 mL，以后每日引出量≤1 000 mL，直至胸水完全吸收。确诊结核性胸膜炎后，给予常规抗结核方案2HRZE/4HR治疗，对年轻患者在急性期加用醋酸泼尼松片30 mg/次（国药准字H44020682，广东华南药业集团有限公司），1次/d，逐渐减量，疗程8周，对有浸润性结核灶、有糖尿病史者和老年人暂缓使用。强化期2～3个月，总疗程6个月以上。

联合组：在对照组治疗基础上给予柴枳半夏汤治疗，每日1剂，水煎至400 mL，早晚两次分服，疗程8周，柴枳半夏汤加减：柴胡12 g，黄芩12 g，四花青皮10 g，枳壳10 g，姜水半夏10 g，桔梗10 g，瓜蒌皮15 g，赤芍10 g，桑根白皮10 g，甘草5 g，加减：咳嗽剧烈、肋痛加白芥子10 g，干呕腹胀加黄连5 g，持续高热加麻杏石甘汤（本研究所用到的中药饮片均采购自康美药业股份有限公司）。

1.5疗效评价（1）按照《中医病证诊断疗效标准》中《悬饮》疗效标准进行评定，治愈：临床症状消失，胸水吸收，实验检查正常。好转：症状好转，胸水减少。未愈：症状、胸水均未改善。（2）采用B超测量胸膜厚度及判断胸腔积液消失时间，记录治疗前后的胸膜厚度（取3个不同的部位测量然后取平均值），胸腔积液消失时间为初次检查时间至复查未见积液时间。（3）记录治疗前后胸水中TGF-β1、TNF-α、IFN-γ mRNA水平的变化，RT-PCR检测：取胸水5 mL，加入适量Trizol试剂，根据说明书提取总RNA，然后使用PrimeScript RT试剂盒从等量的RNA获得cDNA，然后再使用ABI 7500和SYBR Premix ExTaqⅡ进行RT-qPCR。β-actin作为mRNA的定量对照。引物序列如下：TGF-β1 sense：5′-GTGGAAAGCGGCAACCAA-3′，TGF-β1 antisense：5′-GCCCGAGAGAGCAATACAGG-3′；TNF-α sense：5′-CAGCCTCTTCTCCTTCCTGA-3′，TNF-α antisense：5′-GGAAGACCCCTCCCAGATAGA-3′；IFN-γ sense：5′-AGTTATATCTTGGCTTTTCA-3′，IFN-γ antisense：5′-TTCGACTGATTAATAAGC-3′；β -actin sense：5′-TTCCTGGGCATGGAGTCCT-3′；β-actin antiense：5′-TGATCTTCATTGTGCTGGGTG-3′。

1.6统计学方法采用SPSS 19.0专业统计学软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，组间以及治疗前后的比较采用两独立样本配对t检验进行统计分析；计数资料（临床疗效）的比较采用Fisher确切概率法进行统计分析，其中P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1不同组患者临床疗效比较按照疗效标准评定后发现，联合组中治愈的患者有20例，而好转的患者有16例，其临床有效率（90.0%）明显高于对照组（67.5%），经统计分析后显示两组患者临床疗效组间的差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 不同组患者临床疗效对比Tab.1 Comparison of clinical efficacy of different groups of patients 例

2.2不同组患者胸腔积液消失时间以及治疗前后胸膜厚度变化经过治疗后发现，对照组患者胸腔积液消失时间为（16.84±2.97）d，明显长于联合组（12.57±3.10）d，其组间差异具有统计学意义（P＜0.05）。此外，两组患者治疗前胸膜厚度的差异并没有统计学意义（P＞0.05），但是，治疗8周后联合组患者胸膜厚度小于对照组，其组间差异具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

2.3不同组患者治疗前后TGF-β1、TNF-α和IFN-γ mRNA的变化为了进一步探究柴枳半夏汤加减治疗结核性胸膜炎的作用机制，本研究通过RTT-PCR检测两组患者治疗前后胸水中TGF-β1、TNF-α和IFN-γ mRNA的表达水平变化，结果显示，治疗前，两组患者胸水中TGF-β1、TNF-α和IFN-γ mRNA的表达水平并差异没有统计学意义（P＞0.05），但经过8周的治疗后，两组患者胸水中TGF-β1、TNF-α和IFN-γ mRNA的表达水平均发生了显著下调，治疗前后的表达水平下调倍数差异具有统计学意义（P＜0.05）；另外，与对照组相比，联合组患者胸水中TGF-β1、TNF-α和IFN-γ mRNA的表达水平下调更为显著，其组间差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

表2 不同组患者胸腔积液消失时间以及治疗前后胸膜厚度变化Tab.2 The disappearance time of pleural effusion and the changes of pleural thickness before and after treatment in different groups（n=40）±s

表2 不同组患者胸腔积液消失时间以及治疗前后胸膜厚度变化Tab.2 The disappearance time of pleural effusion and the changes of pleural thickness before and after treatment in different groups（n=40）±s

注：与治疗前相比，*P＜0.05；与对照组相比，#P＜0.05

组别 胸腔积液消失时间（d）胸膜厚度（mm）治疗前 治疗8周对照组联合组16.84±2.97 12.57±3.10#5.2±0.67 5.1±0.58 3.9±0.61*3.3±0.46*#

3 讨论

结核分枝杆菌及其自溶产物或代谢产物引起的结核性胸膜炎是一种常见的内科疾病，随着现代生活水平的提高，这种疾病的患者数量也越来越多［3，11］。目前，大部分结核性胸膜炎是急性病，主要表现为结核分支杆菌的全身中毒症状以及胸腔积液导致的局部症状。结核分支杆菌的全身中毒症状为发热、畏寒、出汗、乏力、食欲不振等；胸腔内积液可以刺激胸膜，从而导致反射性干咳，当体位转动时症状会更加明显，而当积液量少时仅有胸闷、气促等症状，一旦胸腔内存在大量积液，则会压迫肺、心和纵隔，出现呼吸困难［12］。目前，对胸腔积液的患者，一般都会采用胸膜腔穿刺术来抽取积液达到治疗效果，然后再结合抗结核方案对结核性胸膜炎进行治疗。大量研究［11，13-14］表明，引起结核性胸膜炎的途径主要有：（1）肺门淋巴结核的结核分枝杆菌经过淋巴管逆流到胸膜；（2）结核杆菌或其代谢产物直接进入到胸膜腔内；（3）急性血行播散性结核导致胸膜炎；（4）胸椎结核或肋骨结核向胸膜腔发生溃破导致胸膜炎等。现有的胸腔镜活检已经证实了大部分结核性胸膜炎壁层胸膜有明显的结核病理改变，因此，结核性胸膜炎的主要发病机制是结核分枝杆菌直接遍及胸膜而导致的［12，15］。刘凌等［16］通过观察比较结核性胸膜炎患者胸水和血清中INF-γ、TNF-α、IL-2、IL-4的含量发现，当结核分枝杆菌及其自溶产物或代谢产物进入胸膜腔时，主要会引起细胞的免疫应答，刺激CD4+淋巴细胞活化增殖，分化为Th1和Th2细胞［17］，Th1细胞分泌的细胞因子主要是INF-γ、IL-2等，能够增强巨噬细胞等免疫细胞直接杀死结核杆菌，结核病患者的Th1细胞介导的细胞免疫通常减弱，而倾向激活Th2细胞，Th2分泌的多种细胞因子如IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等也一定程度上可以抑制Th1细胞的免疫应答，减少Th1型细胞因子生成，降低巨噬细胞、NK细胞等免疫细胞吞噬结核杆菌的能力，从而削弱了保护性免疫应答，这种Th1/Th2细胞的比例失调，容易导致严重的全身性感染，或形成空洞，排菌等［18-20］。另外，处于增殖周期的单核-巨噬细胞和T淋巴细胞还会释放大量的IL-2、TNF-α和IFN-γ，导致结核性胸膜炎患者胸水中细胞因子的活性增强［21］。还有研究［8-9］发现，TNF-α和IFN-γ与胸膜厚度、炎症反应的变化密切相关，可见在结核性胸膜炎的临床评价中，TNF-α和IFN-γ的含量变化可以直接反映药物的疗效。近年来，新的CD4+淋巴细胞亚型，Th3细胞被关注，Th3可能从Th0细胞分化而来，Th3细胞能调节并抑制免疫细胞的增殖、分化及细胞因子的分泌，Th3细胞能分泌TGF-β1，而TGF-β1也能诱导产生Th3，Th3细胞比例与TGF-β1表达水平呈正相关［22-23］。已有研究［24-26］证实，TGF-β1可以通过Smads依赖性信号通路、非Smads依赖性信号通路，以及其他转录相关通路参与到上皮间质转化（EMT）、细胞外基质mRNA转录、胸膜血管新生等过程中。因此，本研究将TGF-β1、TNF-α和IFN-γ，以及胸膜厚度、胸腔积液消失时间作为主要的观察指标来评价药物的临床疗效。

图1 两组患者治疗前后胸水中TGF-β1（A）、TNF-α（B）和IFN-γ（C）mRNA的表达水平Fig.1 The mRNA expression level of TGF-β1（A），TNF-α（B）and IFN-γ（C）in pleural effusion before and after treatment in two groups

目前，已有报道中药汤剂能使降低患者胸水及血清TGF-β1水平，减少胸水产生，降低胸膜增厚粘连发生率［6-7，27］。张伟等［28］通过观察活血化瘀法联合常规治疗对结核性胸膜炎患者胸膜厚度和纤维蛋白原（FIB）的含量变化，发现活血化瘀类中药能够有效降低胸膜的厚度，抑制患者胸水中纤维蛋白原的表达，从而改善疾病的预后情况［29］。《柴枳半夏汤》出自《医学入门》，能和解少阳，清热宣肺，柴胡、黄芩和解少阳，瓜蒌、半夏、枳壳宽胸祛痰利气，青皮、赤芍理气止痛，桔梗、杏仁宣肺止咳，对悬饮初期出现的胸胁闷痛等具有良好的临床疗效。其中柴胡、枳壳、桔梗也被广泛认为具有良好的抗纤维作用［6，30-31］。因此，基于我科在临床上应用柴枳半夏汤加减结合抗结核药及胸腔穿刺引流术治疗结核性胸膜炎取得良好疗效的基础上，采用RT-PCR检测两组患者治疗前后胸水中TGF-β1、TNF-α、IFN-γ的mRNA水平的变化以及胸膜厚度、胸腔积液消失时间等，对两组患者治疗前后临床疗效进行评价，研究发现，两组患者治疗后，联合组的临床有效率明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。对照组患者胸腔积液消失时间明显长于联合组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；联合组患者胸膜厚度明显小于对照组（P＜0.05），表明柴枳半夏汤加减结合抗结核药及胸腔穿刺引流术能够有效缩短胸腔积液消失的时间和减轻患者胸膜增厚的程度。为了进一步探究柴枳半夏汤治疗结核性胸膜炎的作用机制，通过RT-PCR检测发现，治疗后，两组患者胸水中TGF-β1、TNF-α和IFN-γ mRNA的水平发生明显下调，治疗前后的差异有统计学意义（P＜0.05），并且组间比较，差异同样具有统计学意义（P＜0.05），这表明柴枳半夏汤加减结合抗结核药及胸腔穿刺引流术很可能是通过抑制TGF-β1、TNF-α和IFN-γ的基因表达，从而激活机体的免疫反应，促进巨噬细胞、NK细胞等免疫细胞吞噬结核杆菌，并抑制肺组织纤维化的过程，减轻结核性胸膜炎患者胸膜的增厚程度和加快胸腔积液的消失，最终发挥治疗作用。

综上所述，柴枳半夏汤加减结合胸腔穿刺加常规抗结核治疗，比单纯胸腔穿刺加抗结核治疗对结核性胸膜炎更加有效，可能是与联合治疗方法能够抑制TNF-α和IFN-γ的表达，调节机体的免疫反应，抑制炎症反应，进而减轻胸膜增厚有关。另外，柴枳半夏汤加减还能够调节机体气机，降低TGF-β1的表达水平，从而抑制纤维化的程度和纤维蛋白的表达，从而改善结核性胸膜炎患者的临床症状，提高疗效。然而，目前针对中医药方剂结合西药治疗结核性胸膜炎的研究不多，因此，后续需要扩大样本量，进一步研究中医药结合西药治疗悬饮其他辨证分型的疗效，并深入探讨中西医结合治疗结核性胸膜炎的信号通路和作用机制，以期提供更加完善的科学依据，为临床上应用柴枳半夏汤治疗结核性胸膜炎奠定扎实的理论基础。