PVPP吸附茶多酚特性及其在绿茶饮料中的应用

徐 悦 须海荣 孙丽丽 陆 遥 庄丽明 叶俭慧*

(1.浙江大学茶叶研究所，浙江 杭州 310058； 2.亚什兰(中国)投资有限公司，上海 200233)

茶是世界上最受欢迎的饮料之一，市场上也有许多类型的有许多类型的即饮型茶饮料产品，其中大多数是带有风味和香味调节剂的风味茶饮料。由于现在消费者对健康、营养价值及低碳水化合物含量的关注，不添加调味物质的纯茶饮料也越来越受欢迎，尤其是具有更高抗氧化能力的绿茶纯茶饮料。然而，由于生产成本和顾客对价格的可接受度等原因，茶饮料大多以中低档茶为原料，其茶多酚含量高而游离氨基酸含量低，所以市售绿茶纯茶饮料普遍存在苦涩味明显、货架期褐化和茶乳酪形成等问题[1]，导致市场认可度低。茶多酚不仅对茶饮料苦涩味有着重要贡献，同时也是引起茶饮料贮藏期色泽褐变和茶乳酪形成的重要原因。因此，过量的茶多酚可能不利于茶汤质量，应定向去除过多的茶多酚，以改善滋味，减少茶多酚与可溶性蛋白、多糖和咖啡因等络合生成茶乳酪，同时减轻由多酚氧化聚合引起的货架期褐变现象[2]，从而提高茶饮料的感官品质和货架期稳定性。

目前常用的多酚吸附剂有硅胶、膨润土、PVP、PVPP等[3-6]。PVPP(交联乙烯聚吡咯烷酮)作为一种高效的多酚吸附剂，已广泛应用于啤酒、果汁的工业生产中以解决产品的货架期褐变和沉淀问题。国家卫生和计划生育委员会2016年已批准PVPP作为食品工业用加工助剂(吸附剂)在茶饮料中应用。据报道[7-9]，PVPP在茶饮料中可以选择性吸附茶多酚而不影响其他感官品质成分，从而提高茶汤稳定性和品质。然而缺乏用于工艺应用的PVPP处理生产参数，且尚未有茶饮料生产中PVPP残留控制及去除工艺的报道。本实验拟通过PVPP对茶多酚的吸附特性研究，探讨PVPP在绿茶饮料工业生产中的推荐使用参数、添加方式及其对绿茶饮料主要品质成分的影响，同时建立PVPP残留检测方法和去除残留的过滤工艺。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试茶叶：炒青绿茶(上虞健茗茶业有限公司)。

实验试剂：PVPP，平均粒径25μm(美国ASHLAND公司)；活性炭和膨润土(阿拉丁试剂有限公司)；儿茶素标样(日本农林水产省蔬菜茶叶试验站)；咖啡因标样(Sigma公司)；HPLC试剂为色谱纯(天津津美公司)；过滤膜Millex-HV(MerckMillipore公司)；实验其他试剂均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)；纯净水等。

1.2 实验方法

1.2.1吸附剂预处理

PVPP预溶胀：PVPP浸泡在10倍体积的纯净水中充分溶胀1 h以上，PVPP浓度为10%(w/v)。

活性炭预处理：用4倍体积纯净水淋洗活性炭三次，经过抽滤后置于200℃烘箱活化2 h，然后放置于干燥皿中冷却至常温。

1.2.2茶汤浸提 参考GB/T 8312-2013中4.4.1的规定。

1.2.3不同吸附材料对绿茶茶汤主要化学成分的影响 分别向40 ml绿茶茶汤中添加1 g/L活性炭、溶胀PVPP、膨润土。将混合物置于H2S-H水浴振荡器室温15 ℃、转速150 rpm振荡吸附，25 min取样。以未处理的茶汤为对照，待测样品经室温、12000 rpm离心10 min后，取上清液进行检测。

1.2.4PVPP吸附特性的研究

吸附时间：按1.2.3方法，分别向茶汤中添加0.5、1、2 g/L溶胀PVPP，在2、6、10、15、20、25、30、45、60 min取样离心后测定茶多酚。

吸附温度：按1.2.3方法，向茶汤中添加1 g/L溶胀PVPP，处理温度分别为15℃、35℃、55℃、75℃、95℃，于25 min取样离心后检测。

pH值：使用HCl或NaOH调节茶汤pH值至3.5、4.5(原始茶汤)、5.5、6.5、7.5。添加1 g/L溶胀PVPP至不同pH值的茶汤，按1.2.3方法，于25 min取样离心后检测。

茶汤初始浓度：分别等梯度稀释茶汤至原茶汤浓度的0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1倍。添加0.25 g/L溶胀PVPP至各浓度茶汤中，按1.2.3方法，于25 min取样离心后检测。

1.2.5PVPP在绿茶饮料生产中的应用 委托黄山华绿园生物科技有限公司进行灌装绿茶饮料生产。生产参数如下：提取茶水比3%，温度75℃，时间10 min，提取后将茶汤稀释5倍至茶水比0.6%，经过布袋过滤(45μm)，高速离心(14000 rpm、室温、1min)，陶瓷膜过滤(0.5 μm)，最后90～95 ℃下热罐装。

根据国标中(GB/T 21733-2008)对绿茶饮料中茶多酚含量的规定(≥500 mg/L)及绿茶饮料货架期茶多酚的损失规律，本实验中溶胀PVPP处理浓度为0.2 g/L，时间梯度为10 min和30 min，添加方式分为茶汤稀释后添加和提取过程中添加。具体操作如下：以未经PVPP处理的绿茶饮料为对照，在提取稀释后的茶汤(茶水比0.6%)中加入PVPP，混匀后分别吸附10 min(处理一)、30 min(处理二)，再进行后续工艺处理；在绿茶提取时(茶水比为3%)同步加入PVPP，提取10 min后稀释茶汤(茶水比0.6%)，一部分进行后续工艺(处理三)，另一部分继续吸附20 min后(处理四)再进行后续工艺。对所得不同处理的罐装绿茶饮料进行检测。

1.2.6不同过滤工艺去除PVPP残留的效果 向纯净水和1.2.2中提取茶汤中添加1 ppm PVPP，再经过两层滤纸抽滤和0.45 μm膜过滤，分别检测添加PVPP前后以及过滤后样品的浊度。对1.2.5中未经PVPP处理和处理二的绿茶饮料不同工艺步骤的茶汤进行取样罐装并进行浊度和粒径检测。

1.2.7化学成分和生化指标检测方法

茶多酚检测方法：参照GB/T 21733-2008《茶饮料》附录A方法。

游离氨基酸测定方法：参照GB/T 8314-2013茚三酮比色法。

儿茶素类和咖啡碱浓度的测定：使用岛津LC-20A型高效液相色谱仪进行检测。美国Agilent公司TC-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；检测器：Shimadzu SPD ultraviolet detector；柱温：32℃；流动相A为含0.5%乙酸和3%乙腈的水溶液，流动相B为含0.5%乙酸和30%乙腈的水溶液；洗脱梯度：0～35 min时B相由25%线性上升至65%，35～40 min时B相保持在25%；流速：1 ml/min；进样量：10 μL；检测波长为280 nm。

浊度：使用2100N TURBIDIMETER浊度仪进行测定。

色差值：使用Ultrascan VIS色度仪进行测定。

粒径检测：委托浙江大学化学分析测试中心进行粒径检测。测试条件如下：LS13 320激光粒度分析仪，光学模型为Routine. rf780z；Fluid:water；Fluid R.I.: 1.333；Sample R.I.: 1.6 i0；运行时长为20 s；粒径范围为0.375～2000 μm。

2 结果与分析

2.1 不同吸附材料对茶汤主要化学成分的影响

不同吸附材料处理后绿茶茶汤中茶多酚、儿茶素、咖啡因和游离氨基酸总量的变化如表1所示。经1 g/L活性炭、PVPP、膨润土处理后，茶多酚浓度分别从984.4 mg/L下降至933.5 mg/L、570.8 mg/L、874.1 mg/L，茶多酚保留率分别为94.8%、57.9%、88.8%；总儿茶素类浓度分别从793.6 mg/L降低至784.2 mg/L、482.1 mg/L、736.7 mg/L，保留率为98.8%、60.7%、92.8%。说明PVPP对茶多酚的吸附性能显著优于活性炭和膨润土。PVPP处理后，茶汤中酯型儿茶素(GCG、ECG、EGCG、CG)和非酯型儿茶素(GC、EC、EGC、C)的总量为247.2 mg/L和234.9 mg/L，分别是对照的49.8%和83.3%，酯型儿茶素保留率(47.8%～57.3%)明显低于非酯型儿茶素的保留率(67.0%～92.3%)。说明PVPP对酯型儿茶素吸附性能更强，该结果与Zhu等[10]之前的研究结果一致。这可能是因为酯型儿茶素具有更高分子量和更多的羟基，促进了儿茶素与PVPP的结合[9]。

氨基酸和咖啡因是茶叶中另外两种重要品质成分。三种吸附剂处理前后，茶汤中游离氨基酸总量和咖啡因浓度无显著差异(表1)。酯型儿茶素被认为是茶汤苦涩味和茶汤褐变和浑浊的重要因素，而氨基酸浓度与茶汤鲜爽度呈正相关。结果表明，PVPP能够高效吸附茶汤中的多酚类物质，而不影响茶汤中游离氨基酸和咖啡因的浓度。因此，PVPP可用于选择性去除茶汤中过量的多酚类物质，降低酚氨比，改善茶汤滋味。

表1 不同吸附材料处理对绿茶茶汤主要化学成分的影响(mg/L)

注：平均值±标准差。

2.2PVPP吸附茶多酚的吸附特性

在较低茶汤浓度下，吸附时间、温度、pH值和茶多酚初始浓度对PVPP吸附茶多酚性能的影响如图1所示。由图1(A)可知，茶汤中茶多酚浓度随吸附时间的增加而减小。吸附2 min内，不同PVPP浓度处理的茶汤中茶多酚浓度均随时间增加而迅速降低，达到其对应吸附容量的70%左右；吸附2～10 min，茶多酚浓度仍持续下降，但下降速度明显变缓。吸附25 min后，不同浓度PVPP吸附茶多酚均达到吸附平衡，平衡吸附量为350.3～438.4 mg/g。因此，可选择25 min作为PVPP的处理时间，而在实际生产中可适当缩短PVPP的吸附时间。

图1(B)为处理温度对PVPP吸附茶多酚容量的影响。在15～95 ℃范围内，温度条件对PVPP吸附茶多酚的性能无明显影响，具体表现为经不同温度PVPP处理后茶汤中的茶多酚浓度无显著差异(P>0.05)。因此在实际生产中可直接向热茶汤中添加PVPP，无需等待茶汤冷却。

图1(C)为pH值对PVPP吸附茶多酚容量的影响。在pH 3.5～6.5范围内，PVPP对茶多酚的吸附量相当，具体表现为不同pH值的茶汤经PVPP处理后茶多酚浓度无显著差异(P>0.05)。但当pH值为7.5时，茶多酚浓度显著下降(P<0.05)，这可能是因为当pH值>7时茶汤中的部分茶多酚被破坏[10]。市售纯茶饮料的pH值范围为4.5～6.5，在此范围内PVPP对茶多酚具有良好的吸附性能，因此在实际生产中利用PVPP处理茶汤时无需调节茶汤的pH值。

图1(D)为茶汤初始浓度对PVPP吸附茶多酚容量的影响。PVPP对茶多酚的吸附容量随着茶多酚初始浓度的增加呈现先增加后趋于稳定的趋势。当茶多酚初始浓度从299.8 mg/L提高到699.6 mg/L时，PVPP对茶多酚的平衡吸附量从311.8 mg/g逐渐提高到439.5 mg/g，当茶多酚初始浓度继续增加直至999.4 mg/L时，PVPP对茶多酚的平衡吸附量基本稳定在470 mg/g左右。因此，适当提高茶汤的浓度有利于充分利用PVPP的吸附性能。

图1 PVPP对茶多酚的吸附特性(A)吸附时间的影响，(B)温度的影响，(C)pH值的影响，(D)初始茶多酚浓度的影响注：初始茶汤浸提条件为：茶水比0.6%，浸提温度100 ℃，浸提时间45 min

2.3PVPP在绿茶饮料中的应用

2.3.1PVPP处理方法对绿茶饮料化学成分和理化指标的影响 表2为不同PVPP处理方法对绿茶饮料主要化学成分和理化指标的影响。处理一至处理四的茶多酚浓度分别为695.2 mg/L、618.8 mg/L、572.8 mg/L、588.6 mg/L，是对照的95.1%、84.7%、78.4%、80.5%，可见PVPP处理后茶多酚浓度显著下降(P<0.05)。处理三和处理四(茶汤提取时添加PVPP)的茶多酚浓度明显低于处理一和处理二(提取后添加PVPP)。这是因为提取时茶水比为3%，而提取后茶汤被稀释5倍(茶水比0.6%)，因此提取时茶汤中初始茶多酚的浓度显著高于提取稀释后，而单位质量的PVPP对茶多酚的吸附容量随初始浓度增加而增加，因此处理三和处理四的去多酚效果优于处理一和处理二。该结果与图1(D)的实验结果一致。

表2 不同PVPP处理方式对绿茶饮料主要化学成分和理化指标的影响

注：平均值±标准差；同列中不同上标字母差异显著(P<0.05)；相同字母表示差异不显著。

游离氨基酸是茶汤鲜爽味的主要呈味物质，酚氨比是影响绿茶滋味(鲜醇、不涩、爽口)的主要因子[11]，酚氨比高，说明茶多酚浓度相对于游离氨基酸比例高，茶汤苦涩味较明显；酚氨比较小者，茶汤醇度较好，滋味鲜醇。在0.2 g/L PVPP处理后的茶汤中游离氨基酸总量略微低于未经PVPP处理茶饮料。而PVPP各处理下绿茶饮料的酚氨比有显著下降(P<0.05)，处理三和处理四达到最低的酚/氨比值2.7。这说明处理三和处理四的茶汤较未经PVPP处理的绿茶饮料苦涩味弱。

未经PVPP处理茶饮料的浊度为0.4 NTU，处理一至处理四的浊度分别为0.4 NTU、0.3 NTU、0.2 NTU和0.2 NTU，处理三和处理四的浊度明显低于对照。可见浊度的变化趋势与茶多酚浓度变化趋势一致。因为茶饮料中的茶多酚能与蛋白质、咖啡因、多糖等络合形成茶乳酪。通过PVPP处理可以适当减少茶饮料中的茶多酚浓度，从而减少了茶乳酪的形成。

从茶多酚吸附效果、绿茶饮料品质改善、操作简便性等总体来看，PVPP在茶汤提取时同步处理10 min(处理三)效果最佳，该方法操作简单，没有延长茶饮料的生产流程，绿茶饮料品质优，适用于工业化生产。

2.3.2PVPP处理方法对绿茶饮料汤色的影响 通过色差值L*、a*、b*可描述不同PVPP处理前后绿茶饮料的汤色变化。其中，L*为明度值，△L 为明度偏差量，正数代表偏亮，负数代表偏暗；a*值为红绿色度，△a为红绿偏差量，正值代表偏红，负值偏绿；b*值为黄蓝色度，△b为黄蓝偏差量，正值代表偏黄，负值偏蓝；△E反映色差综合偏差量，△E大于6说明与对照样品颜色有显著差异。以未经PVPP处理的绿茶饮料为对照，经不同PVPP处理后绿茶饮料汤色色差参数如表3所示。不同PVPP处理对应的△L值显著上升，△a略有下降，△b显著下降。处理一和处理二的△E值低于3，说明茶汤色泽变化并不明显。处理三和处理四的△E值大于6，说明茶汤色泽显著变化，亮度提高，绿度、黄度降低(P<0.05)。图2为绿茶饮料不同PVPP处理下的照片。与未经PVPP处理的相比，PVPP处理后的茶汤汤色均变清亮，且处理三和处理四的汤色明显比处理一和处理二更为清亮。已有研究表明茶汤色差参数与汤色感官审评结果存在相关性[12]。茶多酚中黄酮醇及其苷类、黄烷酮、花青素等是形成茶汤黄绿色的重要物质[13]，PVPP通过吸附茶多酚，从而提高茶汤亮度，降低黄度、绿度。

表3 不同PVPP处理下绿茶饮料色差值变化

注：平均值±标准差

图2 不同处理下绿茶饮料中汤色的变化

2.4 过滤工艺对PVPP残留的影响

2.4.1添加极低限量PVPP 对溶液浊度的影响 如图3(A) 所示，添加1 ppm PVPP后，水溶液的浊度由0.056 NTU显著上升至0.130 NTU(P=0.05)，经抽滤和膜过滤后，浊度下降至0.058 NTU，与未添加PVPP的纯净水无显著差异。可见，浊度仪能敏锐检测到PVPP的痕量残留(～1 ppm)，且通过抽滤+膜过滤两步方法就能有效去除水溶液中的PVPP，将PVPP残留量控制在1 ppm以下。

将该PVPP残留检测方法应用到茶饮料中，以绿茶茶汤为例。如图3(B)所示。添加1 ppm PVPP后，经抽滤和膜过滤的茶汤(对照)浊度从4.49 NTU显著上升至5.21 NTU(P=0.05)，抽滤和膜过滤后浊度为3.16 NTU，显著低于对照(P=0.05)。说明该方法可以用于检测茶饮料中PVPP痕量残留，且PVPP处理可降低茶汤浊度。

图3 1 ppm PVPP 对水和茶汤浊度的影响 注：图中*表示差异显著(P<0.05)

2.4.2不同过滤工艺去除绿茶饮料PVPP残留的效果 未处理和PVPP处理绿茶饮料在布袋过滤、高速离心、陶瓷膜过滤后的浊度变化如图4所示。添加0.2 g/L PVPP后，绿茶饮料浊度从19.97 NTU上升至105.00 NTU。随着过滤工艺的进行，未处理和PVPP处理的绿茶饮料中浊度均明显下降。在布袋过滤后，PVPP处理绿茶饮料的浊度下降至40.30 NTU，但明显高于对照的16.80 NTU，说明仅布袋过滤不足以完全去除绿茶饮料中的PVPP。再经高速离心后，对照和PVPP处理的绿茶饮料浊度无差异，再经陶瓷膜过滤处理后，PVPP处理的茶饮料浊度0.21 NTU低于对照的0.39 NTU。根据2.4.1，1 ppm的PVPP残留就可显著增加溶液的浊度，而本实验中PVPP处理绿茶饮料经布袋过滤+高速离心后的浊度与对照无差异，这说明仅通过这两步绿茶饮料生产中的常规过滤工艺就完全可以将PVPP的可能残留控制在1 ppm之内，同时有效减少茶饮料的浊度值，达到市售绿茶饮料的一般浊度(3.5～4.5 NTU)，如再经膜过滤可显著提高绿茶饮料的澄清度。

图5为不同过滤工艺后PVPP处理绿茶饮料粒径分布。本实验中使用的PVPP粒径分布范围为15～30 μm，而在0.375～38 μm范围内，未处理和PVPP处理的茶饮料经布袋过滤+高速离心后在均未检测到粒径分布，说明经布袋过滤+高速离心后即可以完全去除PVPP。粒径分布结果与浊度结果一致，说明浊度可敏锐反映PVPP的残留。茶乳酪可以通过过滤工艺去除，但在茶饮料中呈游离态存在的茶多酚、咖啡碱、蛋白质等物质在茶饮料贮藏或冷却期会络合形成茶乳酪[14]。绿茶茶饮料的茶乳酪粒径显著大于红茶茶乳酪[16]，而红茶茶乳酪的粒径分布集中在0.2～0.6 μm和 3～70 μm[15]。所以粒径分布中40～300 μm范围中可能是在茶饮料货架期重新形成的茶乳酪。

3 讨论

本研究比较了PVPP与活性炭、膨润土的去除多酚效果，并对PVPP处理时的吸附时间、温度、pH值、初始茶汤浓度等影响因素展开研究，结果表明：PVPP能有效去除绿茶饮料中过多的茶多酚，而基本不影响其他品质化学成分，PVPP对茶多酚吸附能力强，处理时间较短，且吸附过程受到温度和pH值的影响很小。具体表现为：，PVPP对茶多酚的吸附在2 min 内达到吸附平衡容量的70%， 25 min内达到吸附平衡，平衡吸附量约为470 mg/g；在15～95 ℃、pH值 3.5～6.5范围内[17-18]，PVPP对茶多酚的吸附容量基本稳定。因此使用PVPP处理绿茶饮料时可不调节茶汤的pH值并趁热添加。

探究了PVPP在绿茶饮料工业化生产中的最佳添加方法是茶汤提取时同步添加PVPP(10 min)，证明PVPP处理能有效减少绿茶饮料中的茶多酚浓度，对游离氨基酸浓度影响较小，有效降低酚氨比，优化滋味，提高亮度，改善汤色和澄清度。建立了浊度检测控制PVPP残留的方法，将PVPP残留的检测浓度控制在1 ppm。研究去除PVPP残留的过滤工艺，证明通过布袋过滤和高速离心两步常规过滤工艺能基本去除茶饮料中的PVPP残留。