碱性橙Ⅱ纯度标准物质的研制

黄彦捷 周瑾艳 陈玲 许俊斌 尹强 花秀兵 王世超 林铿 黄振宇 吴朝阳

摘   要：通過原料提纯、定性分析、定量分析、均匀性试验、稳定性试验、联合定值和不确定度评定等方法对碱性橙Ⅱ的纯度标准物质进行了研究.对市售的碱性橙Ⅱ原料进行重结晶，制备了候选标准物质.候选物经提纯、干燥后，封装在棕色玻璃瓶中. 采用分层随机抽样的方法，选取数个样品瓶进行均匀性和稳定性的研究，结果表明所制备的碱性橙Ⅱ标准物质具有良好的均匀性和足够的稳定性. 利用红外光谱、高分辨质谱和核磁共振H谱确证了碱性橙候选标准物的化学成分. 联合了7个资质实验室进行了合作认证. 采用质量平衡法（含液相色谱法面积归一化分析、含水率、灰分含量及残留溶剂分析）对其进行了纯度分析. 结果表明，该标准物质的纯度认证值为99.2%，相对扩展不确定度为1.0% （k=2）. 该纯度标准物质已被鉴定为国家二级标准物质，编号为GBW（E）100372，可望用于食品和化妆品分析中的仪器校准和方法评定.

关键词：计量学;碱性橙Ⅱ;标准物质;液相色谱;质量平衡法

中图分类号：O657.7                               文献标志码：A

Research on a Purity Certified Reference Material of Basic Orange Ⅱ

HUANG Yanjie1，2，ZHOU Jinyan2，CHEN Ling1，2，XU Junbin1，2，YIN Qiang1，2，

HUA Xiubin2，WANG Shichao2，LIN Keng2，HUANG Zhenyu1，2，WU Zhaoyang3

（1. South China National Center of Metrology，Guangzhou 510405，China;

2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Modern Geometric and Mechanical Metrology Technology，

Guangdong Provincial Institute of Metrology，Guangzhou 510405，China;

3. College of Chemistry and Chemical Engineering，Hunan University，Changsha 410082，China）

Abstract： A purity certified reference material for Basic Orange II was studied by means of raw material purification， qualitative analysis，quantitative analysis，homogeneity test，stability test，as well as characterization and uncertainty evaluation. The candidate standard substance was prepared by recrystallization of purchased Basic Orange II. The candidates were purified，dried，and then encapsulated in brown glass bottles. The homogeneity and stability of several sample bottles were studied by stratified random sampling. The chemical composition of the candidate reference material of Basic Orange II was confirmed by infrared（IR） spectrum，high resolution mass spectrometry （MS） and proton nuclear magnetic resonance（NMR）. 7 qualified laboratories were cooperated for certification of Basic Orange II. The purity of the product was analyzed by mass balance method （concluding area normalization， water content， ash content and residual solvent analysis by liquid chromatography）. The results showed that the certified value of the purity reference material was 99.2% and the relative expansion uncertainty was 1.0%（k = 2）. The purity reference material was identified as the national grade II certified reference materials，which was numbered GBW（E）100372，and was expected to be used in the calibration of instruments and method evaluation in food and cosmetic analysis.

Key words： metrology;basic orange II;reference material;liquid chromatography;mass balance

食用色素是一种能在一定程度上改变食物原有颜色的食品添加剂. 合理利用食用色素，可以使食物颜色更加丰富多彩，对人们的食欲也有促进作用.但随着食用色素安全性实验技术的发展，发现有的合成色素有致癌作用，能诱发染色体变异. 然而某些非食用色素却因其价格低廉、着色力强、稳定性好等优点一次又一次流入食品生产线.针对一系列合成食用色素的检测方法也不断被开发出来[1-4].

自2008年至今，我国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治领导小组已陆续发布了6批《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》，其中可能违法添加的非食用物质名单中有7种为常见工业染料，常被用作着色剂非法添加到食品中，分别是苏丹红、玫瑰红B（罗丹明B）、王金黄（碱性橙Ⅱ）、酸性橙Ⅱ、碱性嫩黄O、美术绿、孔雀石绿、碱性黄等.因此，研制这些非法色素的有证标准物质，为食品安全检测和监督管理提供重要的技术支撑，具有非常重大的意义.近年来，多种色素类有证标准物质已经被开发出来[5-7].

碱性橙Ⅱ（Basic Orange Ⅱ，Chrysoidine G）是一种偶氮类碱性工业染料，属于碱性橙类染料的一种.在实际生活中碱性橙Ⅱ可用于豆制品染色，一些不法商贩常用碱性橙Ⅱ对豆腐皮和黄鱼进行染色[8-10]，严重危害消费者的身体健康. 《中华人民共和国食品添加剂使用卫生标准》及《中华人民共和国食品卫生法》规定，碱性橙Ⅱ为禁止用作食品添加剂的化学制剂.

本研究依据一级标准物质研制技术规范（JJF 1006—1994）[11]以及ISO 17034、Guide 35的技术要

求[12-13]，采用质量平衡法，利用高效液相色谱[14-16]对碱性橙Ⅱ纯度物质进行准确定值，并全面考察碱性橙Ⅱ纯度测量过程中的各种影响因素（溶剂残留、水分、灰分等）. 对样品的均匀性、测量的分散性及其他因素引入的不确定度分量分析和确定后，给出了整个测量过程不确定度的合成结果，并对碱性橙Ⅱ纯度标准物质的稳定性均进行了30个月的考察. 结果表明，碱性橙Ⅱ纯度标准物质性能良好，可满足食品、药品、日化、环境保护及化工产品研究和检测的需要，可望用于相关仪器（色谱仪）的校准、分析方法评价，为统一相关量值发挥应有的作用.

1   材料与方法

1.1   试剂与材料

碱性橙Ⅱ纯品原料（纯度>95%，ACROS公司）;甲醇、乙醇（HPLC试剂，德国Merck & Co Inc公司）;实验用水均为实验室制备的超纯水. N，N-二甲基酰胺（HPLC试剂，百灵威）.

1.2   仪器设备

标准物质制备用器皿：500 mL的A级容量瓶（天津玻璃仪器厂）;准确度为十万分之一天平（CPA225D赛多利斯，德国）;电动移液器（Brand，法国）;百级洁净台等，皆经检定合格.

Tensor-37傅里叶红外光谱仪（美国Bruker）;高分辨质谱仪（美国Agilent 6540 Q-TOF）;核磁共振氢谱（DPX-300型，美国Bruker）;Milli-Q Advantage A10纯水系统（美国Millipore公司）.

1.3   实验方法

1.3.1   样品处理及定性分析

采用市售高纯碱性橙Ⅱ为原料，以体积比为3∶1的乙醇-水溶液作为溶剂在80～100 ℃溶解原料碱性橙Ⅱ，分次加入体积比为1 ∶ 1的乙醇-水溶液，同時不断搅拌，保持温度在（100±5） ℃范围内，热过滤后，将滤液冷却室温，随后放置在温度为4 ℃的条件下进行重结晶，结晶体过滤后，置于温度为105 ℃条件下干燥，经研磨过筛、混匀、干燥后即得碱性橙Ⅱ标准物质，并将其置于填充有五氧化二磷的干燥器中干燥24 h，为后续实验备用.

将纯化后的碱性橙Ⅱ纯度样品分装于棕色玻璃样品瓶中，每瓶200 mg，共分装约400瓶. 将封装好的样品放置于4 ℃冰箱中保存.

进行纯度测试之前，分别采用红外光谱法、高分辨质谱法和核磁共振H谱对候选碱性橙Ⅱ纯度标注物质进行定性分析，将实验所得谱图及与标准谱图（Spectral Database for Organic Compounds，SDBS）进行对照.

1.3.2   质量平衡法

1）联合定值. 碱性橙Ⅱ候选物的纯度采用多家实验室合作定值，定值方法为液相色谱面积归一化法.每家实验室仪器使用前均经法定计量机构检定合格，各实验室从全部样品中随机抽取3个包装，从每瓶中任意取出1～3个子样，用色谱级甲醇当溶剂配制测试液，使用液相色谱法测量碱性橙Ⅱ纯度标准物质.

液相色谱方法：选取二极管阵列检测器，C18色谱柱，以甲醇和0.2 mol/mL的乙酸铵为流动相，配比为65 ∶ 35，流速为1.0 mL/min，设定检测波长为407 nm.

2）测定溶剂残留. 采用顶空进样-气相色谱法

分析碱性橙Ⅱ中可能的溶剂残留为乙醇[17]，称取适量样品溶解在N，N-二甲基酰胺中，在105 ℃温度下平衡60 min，采用静态顶空-GC-FID检测器测定残留溶剂，采用标准加入法定量分析残留溶剂.

3）测定水分. 碱性橙Ⅱ候选物纯品的水分采用卡尔费休水分测定仪测试，准确称取适量样品，约1 g左右，精确到0.01 mg，重复测量6次，取平均值作为水分测试结果.

4）测定灼烧灰分. 碱性橙Ⅱ候选物纯品的灰分通过高温灼烧测得，准确称取适量样品，约1 g左右，精确到0.01 mg，在（650±50） ℃的马弗炉中灼烧至恒重，称重测得结果，重复6次测量，取平均值作为实验结果.

1.3.3   均匀性分析

标准物质均匀性试验通常是随机选择一定数量的样品，采用高精度试验方法进行试验. 参照标准物质技术规范，分别从400瓶已经分装好并编上号码的碱性橙Ⅱ纯度样品中按照头尾、中间编号各随机抽取15瓶样品. 准确称量抽取的样品约10 mg，配制成溶液，采用液相色谱-面积归一化法测定纯度，每瓶样品平行进样3次，每次测量的平均值作为均匀性评价的结果，然后对其进行方差分析.

1.3.4   稳定性检验

1）长期稳定性. 长期跟踪标准物质的稳定性，

按照前紧后疏的原则，对碱性橙Ⅱ纯度标准物质稳定性进行了长期稳定性考察，为期30个月. 考察稳定性采用液相色谱法，应用面积归一化法，在不同的时间间隔内进行比对测量.每次随机抽取3瓶样品进行平行测量，取平均值作为稳定性考察结果.

2）短期稳定性. 为了考察运输条件对标准物质的稳定性影响，并综合考虑到南方的高温天气，实验模拟了运输条件，随机抽取6瓶样品，分别置于运输条件下（（60±5） ℃，培养箱中）和常规储存条件下（（4±1） ℃）保存一个星期，对比两种不同条件对其稳定性影响（以测量温度60 ℃为例）.

2   结果与分析

2.1   定性分析

分别采用傅里叶变换红外光谱（FTIR）、高分辨质谱法和核磁共振H谱对碱性橙Ⅱ纯度标准物质候选物进行定性分析[18]，实验所得谱图及与标准谱图SDBS进行对比.图1给出了不同波长λ下碱性橙Ⅱ纯度标准物质候选物的透射率T，从图1中可以找到位于1 250～1 750 cm-1的芳环特征骨架振动和N=N双键振动.图2中δ = 4.79为溶剂重水中氢的峰. 谱图积分为9个氢（不包括HCl），结构上为8个氢，可见候选物1H-NMR与碱性橙Ⅱ的结构吻合. 在高分辨质谱中可以找到m/z=213.114的分子离子峰，高分辨率质谱检索匹配度为99.1%. 3种谱图结果证明纯度物质候选物的主要成分确为碱性橙Ⅱ.

2.2   均匀性分析

标准物质的均匀性是衡量其性能的重要指标，也是测量值准确传递的重要依据，它用来描述标准物质特性的空间分布特征.标准物质的特性量值应当是均一的，即在一定的细分范围内，特性量值保持不变.将均匀性考察的数据在95%的置信概率下进行方差分析，作为样品的均匀性结果[12]，计算结果列于表1和表2中.

注：SS为标准方差;df为自由度;MS为平均方差;F-value为F值，用于衡量拟合显著程度;P-value为P值，用于衡量组间差异大小;F-crit为F临界值.

由表2中数据可得：

式中：S1为样品组间标准偏差;S2为组内标准偏差.经计算F < Fα，表明样品间不存在明显差异.

因为S21 < S22，此时均匀性产生的标准偏差按下式计算：

均匀性检验方法重复性的标准偏差：

从计算可以看出，碱性橙Ⅱ纯度样品测量结果的统计量F值小于均匀性检验临界值Fα=2.037，证明该碱性橙Ⅱ纯度样品是均匀的.各样品瓶间的不均匀性所产生的标准偏差与均匀性检验方法重复性的标准偏差大小相近，计算总的不确定度必须把均匀性因素考虑进去. 统计方法显示，碱性橙Ⅱ纯度标准物质均匀性良好，样品最小取样量为10 mg.

2.3   稳定性检验

标准物质的稳定性是指被定值的特性量随时间变化的情况，其稳定性主要受物理、化学和保存条件等因素的影响.需要用精密度高的分析方法对其进行长时间的定期考察来确定相对的稳定期限.其中，长期稳定性是指标准物质特性随时间延续的稳定性，碱性橙Ⅱ纯度标准物质长期稳定性详见表3和表4.

由于没有一种物理/化学模型能够真实地描述该候选标准样品的降解机理，故采用直线作为经验模型，以X代表时间，以Y代表碱性橙Ⅱ纯度标准物质的值，拟合成一条直线，则直线的斜率为：

由于b1 < t0.95，n-2·s（b1），故斜率是不显著的. 因而未观测到不稳定性，即表明在30个月内，该回归是不显著的（sig.F = 0.356 7 > 0.05），即碱性橙Ⅱ纯度标准物质的量值没有发生明显的趋势性变化，这说明所采取储存条件有效地保证了碱性橙Ⅱ纯度标准物质量值的稳定性.

短期稳定性是指在运输条件下标准物质在运输过程中的稳定性.碱性橙Ⅱ纯度标准物质的短期稳定性考察结果见表5.

对储存条件和运输条件下的測量数据进行相同的统计分析，发现两种条件下标准物质量值没有发生显著变化.

通过长期稳定性和短期稳定性考察，在稳定期为30个月内，碱性橙Ⅱ纯度标准物质稳定性良好，量值没有发生明显变化，即储存条件和运输条件很好地保证了标准物质的稳定性.

2.4   质量平衡法

根据质量平衡法即扣除杂质法可得纯度为：

纯度 = [100% - W （非挥发性杂质）] ×

[100%-W （溶剂残留）-W （水）-W （灰分）] × 100%

（11）

碱性橙Ⅱ纯度物质中主要非挥发性杂质采用气相色谱面积归一化法测定，溶剂残留采用顶空GC分析，水分含量由卡尔费休法测定，灼烧灰分通过对比灼烧前后样品质量的差异测量.

2.4.1   多家实验室联合定值（液相色谱面积归一化法）

按照“国家一级标准物质技术规范”的要求，主成分纯度采用多家实验室合作定值，所采用的定值方法为液相色谱面积归一化法. 8家实验室定值的实验结果列于表6中.我们采用狄克逊准则和格拉布斯准则对所有数据进行可疑值分析，未发现可

疑值.

2.4.2   溶剂残留测试

碱性橙Ⅱ纯品原料在加工过程中，易残留的溶剂为乙醇[15]，采用顶空进样-气相色谱仪法对碱性橙Ⅱ和乙醇进行测试，发现在顶空条件下，碱性橙Ⅱ溶液中未检出乙醇等溶剂.

2.4.3   水分的测定

碱性橙Ⅱ纯度物质水分测试采用卡尔费休水分测定仪测试，重复测量6次，取平均值作为水分测试结果，得到结果如表7所示.

根据格拉布斯（Grubbs）准则[15]，对6组数据按大小重新排列，对残差最大值的0.21进行分析. 在概率P=95%条件下，其残差的绝对值与实验观测数据标准偏差之比小于格拉布斯临界值，即

2.4.4   原料灰分测试

灰分测试是估计无机杂质总量的一种方法. 碱性橙Ⅱ纯度灰分通过高温灼烧测得，称取适量样品，在（650±50） ℃的马弗炉中灼烧至恒重，称重测得碱性橙Ⅱ纯度灰分结果，重复测量6次，取平均值作为实验结果，得到结果如表8所示.

同理，根据格拉布斯准则，对6组数据按大小重新排列，对残差最大值的0.11和0.18进行分析，在概率P = 0.05条件下，其残差的绝对值与实验观测数据标准偏差之比小于格拉布斯临界值，即

综上，计算得到质量平衡法测得碱性橙Ⅱ纯度值为：

W总 = W × （1 - W H2O - W灰分）=

99.52% × （100% - 0.15% - 0.14%）=

99.2%                  （13）

2.5   不确定度评定

根据JJG 1006—1994 《一级标准物质研制技术规范》及JJF 1343—2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》的规定[11，19]，明确标准值的总不确定度由3部分组成.第1部分是碱性橙Ⅱ定值实验引入的不确定度（u定值）;第2部分是样品不均匀产生的不确定度（ubb）;第3部分是样品不稳定产生的不确定度（uIts）.

2.5.1   定值引入的不确定度

多家实验室协作的定值不确定度可采用方差分析来进行估算[12].表9为碱性橙Ⅱ纯度标准物质定值结果单因素方差分析.

总平均值的不确定度计算如下：

根据水分测量的数据，测定的R=0.1%，n=6（查表c=2.53），采用极差法计算水分引入的不确定度分量为：u H2O = R/c = 0.04%.

根據灰分测量的数据，测定的R=0.07%，n=6（查表c=2.53），采用极差法计算灰分引入的不确定度分量为：u 灰分 = R/c = 0.03%.

因此定值引入总的不确定度为：

2.5.2   均匀性产生的标准不确定度（ubb）

由均匀性部分计算结果可知，样品瓶间不均匀性所产生的标准偏差必须并入到总的不确定度中.因此，样品间不均匀的标准偏差为：

2.5.3   稳定性引入的不确定度（uIts）

根据碱性橙Ⅱ长期稳定性的实验数据（表3）及回归方差结果（表4）可知，有效期t=30个月的长期稳定性的不确定度贡献为：

uIts = sb·t = 8.5 × 10-3 × 30 = 0.255%  （19）

2.5.4   标准物质总的不确定度

扩展不确定度：

U95 = k × u总 = 2 × 0.272% = 0.54%≈1.0%  （21）

碱性橙Ⅱ纯度标准物质的定值结果为：

W = （99.2 ± 1.0）%，k = 2    （22）

3   结   论

本文对碱性橙Ⅱ纯度标准物质的均匀性和稳定性进行了充分研究，多家实验室参与了纯度值的联合测定.这一系列数据已成功应用于实际样品的测量，并且取得了令人满意的结果. 该样品已申报国家二级标准物质并获批，其标准物质编号为：GBW（E）100372. 该标准物质可以满足食品、医药、日常化学品、环保、化学产品研究和测试需求，也将用于对相关仪器（例如比色板、荧光分光光度计等）校准和分析方法的评估.

致谢：感谢安捷伦科技（中国）有限公司广州分公司、广东省兽药饲料质量检验所、东莞市食品药品检验所、东莞市水务监测中心、广东中测食品化妆品安全评价中心有限公司、中国广州分析测试中心、广东产品质量监督检验研究院食品检验室等7家实验室对样品进行了联合定值.

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