黄油中8种类固醇激素的液相色谱/串联质谱检测

2014-12-16赵超敏岳振峰吴晖欧阳姗赖富饶�ば

分析化学 2014年3期

赵超敏+岳振峰+吴晖+欧阳姗+赖富饶�ばこ鹿�+张毅+康海宁+华红慧

摘要建立了黄油中雌酮、α 雌二醇、β雌二醇、雌三醇、睾酮、表睾酮、孕酮和丙酸睾酮8种类固醇激素的凝胶渗透色谱（GPC）液相色谱/串联质谱（LC MS/MS）检测方法。样品用乙酸乙酯环己烷（1∶1，V/V）提取，提取液经GPC柱净化除脂，GPC浓缩液采用C18色谱柱（100 mm×2.0 mm i.d.， 3.0 μm）分离，以乙腈和水为流动相进行梯度洗脱，电喷雾电离多反应监测模式进行定性和定量分析。8种类固醇激素以基质匹配外标法定量，药物在1.0～20.0 μg/kg线性范围内相关系数（r）均大于0.999；方法检出限（S/N=3）为0.04～0.30 μg/kg，定量限LOQs（S/N=10）为1.0 μg/kg；添加水平为1.0， 2.0， 4.0 μg/kg时，回收率范围在64.1%～110%之间；相对标准偏差（RSD）小于11%。结果表明，本方法准确、可靠，满足黄油中8种类固醇激素的检测分析要求。

关键词雌性激素；雄性激素；孕激素；黄油；液相色谱串联质谱；凝胶渗透色谱

1 引言

激素分析一直是诊断类固醇激素合成和代谢紊乱的重要手段[1]。动物源食品中激素残留的检测经常被报道，因为激素可被用于畜牧业以提高饲料转化率，达到促进动物生长发育、动物的同期发情及增加体重和育肥等目的，如雌二醇和睾酮等[2]。动物源食品中的激素残留通过食物链进入人体会产生健康危害，如生长发育障碍、出生缺陷和生长发育缺陷等[3]。我国农业部176号[4]、193号[5]和235号公告[6]明确规定，在动物食品中不得检出雌二醇和丙酸睾酮等激素类药物，许多国家和地区已禁止某些类固醇激素作为动物促生长剂[7]。黄油主要由甘油三酯（98%）、甘油二酯、单甘油酯和游离脂肪酸组成，已确定的脂肪酸约有500种，其它组分包括磷脂、脑苷脂、固醇、脂溶性维生素（VA， VD和VE）、色素（胡萝卜素）、矿物质和风味组分等。其中亚油酸的异构体共轭亚油酸具有抗癌、抗动脉粥样硬化、抗高血压和提高免疫力等功能；人类共轭亚油酸主要来自反刍动物食品，奶制品约占70%[8～12]。黄油因其营养价值、供能特性、良好的质构和口感特性而受到广泛欢迎，越来越多地被用于焙烤工业和餐饮业，中国2012年黄油累计进口量同2011年相比，同比增加10.6%[13]。人造黄油虽和黄油具有类似的食品加工特性，但其主要成分为氢化植物油和食品添加剂，基本没有激素残留的风险，营养价值也较差。关于动物源食品中激素的研究报道多是关于猪肉、牛肉[14]、羊肉、鸡肉和肝脏[15]、牛奶[16]、鸡蛋[17]和水产品[18]等，尚未见到黄油等高脂肪含量样品的报道。

黄油脂肪含量高，因此选择去除油脂效果良好的凝胶渗透色谱法（GPC）净化。GPC净化技术已成功应用于农药残留分析[19～21]，近年来也有关于药物残留分析的报道，只有少量报道是关于激素分析[22，23]。类固醇激素的常用检测分析方法有GC MS法和LC MS/MS法等[24，25]，但是GC MS法灵敏度低，并且需要衍生化，过程复杂且耗时；LC MS/MS法灵敏度高、重复性好、分析时间短，因此本文选择了全自动GPC净化系统与LC MS/MS相结合检测黄油中的8种类固醇激素（图1），净化效果好、回收率高、灵敏度高和重现性好，满足残留分析技术要求。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

API5000型三重四级杆串联质谱仪配电喷雾离子源（美国AB公司）；1200型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；全自动凝胶净化系统（GPC Vario，德国LCtech公司）；漩涡振荡器（德国Heidolph公司）；低温离心机（美国Sigma公司）；往复式振荡器（日本Yamato公司）；恒温振荡水浴摇床（德国Julabo公司）；全自动氮吹仪（美国Caliper公司）；移液器（法国Gilson公司）。

类固醇激素标准物质睾酮、17α雌二醇、17β雌二醇、雌三醇、雌酮、孕酮、丙酸睾酮和表睾酮（纯度≥98%）购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、环己烷、乙酸乙酯和乙腈（HPLC级）购自美国TEDIA公司。

黄油样品：市售进口黄油（非人造黄油）。

2.2 GPC条件

2.3 色谱/质谱条件

2.3.1 色谱条件雌性激素负离子模式：流动相A为水，流动相B为乙腈。液相洗脱条件为： 0.0 min（35%B）

SymbolnB@ 18.0 min（35%B），进样量： 10 μL，流速： 250 μL/min。

雄性激素与孕激素正离子模式：流动相A为水，流动相B为乙腈。液相洗脱条件为： 0.0 min（35%B）

2.3.2 质谱条件负离子模式（ESI

Symbolm@@ ）：碰撞气压41.4 kPa，气帘气压241.3 kPa，雾化气压275.8 kPa，去溶剂气压482.7 kPa，离子喷雾电压

Symbolm@@ 4500 V，离子源温度500 ℃。

正离子模式（ESI+）：碰撞气压41.4 kPa，气帘气压241.3 kPa，雾化气压275.8 kPa，去溶剂气压482.7 kPa，离子喷雾电压5500 V，离子源温度500 ℃。

2.4 样品处理称取1g样品（精确到0.01g）于15 mL具塞离心管中，加5 mL环己烷/乙酸乙酯（1∶1，V/V）涡旋1 min，溶解后定容至10.0 mL，定容液往复振荡20 min和45 ℃下水浴5 min，然后在9500 r/min下离心5 min，收集上清液至GPC样品瓶中，经GPC净化、浓缩，浓缩液40 ℃氮气吹至近干，用35%乙腈溶液溶解浓缩物并定容至1.0 mL，过0.22 μm滤膜，供测定。

3 结果与讨论

3.1 提取溶剂的选择

激素常用提取溶剂为乙腈[26]、甲醇[17]和叔丁基甲醚[2]。激素是分子量较小的脂溶性物质，样品中激素含量与脂含量成正比[27]。黄油是新鲜牛奶加以搅拌之后上层的浓稠状物体滤去部分水分之后的产物，其含脂量高，常用提取溶剂对其溶解性差，叔丁基甲醚和正己烷可溶解黄油，但溶解效果低于乙酸乙酯/环己烷。乙酸乙酯/环己烷（1∶1，V/V）能溶解油脂，且溶解黄油为澄清溶液，乙酸乙酯/环己烷也是凝胶色谱常用流动相，因此选择乙酸乙酯/环己烷（1∶1，V/V）作为提取溶剂。

3.2 GPC净化条件的确定

黄油含脂量高，激素脂溶性强，基质效应严重，有效去除油脂是准确测定黄油中激素的关键。GPC根据被分离物质分子量大小不同而分离，能有效去除油脂和色素等大分子物质。选择型号40010凝胶柱，Bio Beads SX 3是为柱填料。流动相选择沸点一致的乙酸乙酯（77 ℃）和环己烷（88.7 ℃），因沸点一致比例不会发生显著变化，洗脱条件较稳定。进样量为5 mL，检测波长为254 nm。

GPC净化主要是切割时间点的选择，要充分考虑排除的基质与待测物的分离情况，如凝胶色谱图2所示，当流速为4.7 mL/min时，大分子物质油脂的保留时间在4～9 min，10 min时被完全洗脱下来，因此本实验前运行时间设计为10～11 min，其间隔周期为10 s；主收集时间设计为16.5， 20， 33和50 min。如图3A所示，前运行时间在10 min 时加标回收率最高，但是在10.5 min之前存在基质效应，有部分油脂被接收，因此综合考察加标回收率、除脂效果和基质效应，最终选择前运行时间为10.5 min；图3B所示，主收集时间在33 min时回收率最大，时间即使再延长回收率也变化不大，因此选择主收集时间为33 min；流速分别考察了4.0， 4.5和4.7 mL/min，结果显示，在获得相近回收率情况时，增大流速，缩短了样品的前运行时间和主收集时间，因此为了缩短样品处理时间，流速选择为4.7 mL/min。

GPC净化后结合SPE柱（Florisil柱：6 mL，1 g，Supelco）净化结果发现，单独使用GPC净化与GPC SPE联用净化效果相同，但是GPC SPE联用的加标回收率稍低于单独使用GPC，因此，为了减少目标物的损失，只选择GPC净化就能满足实验要求。

3.3 质谱条件的优化

取浓度为1.0 mg/L的各激素标准溶液，采用微量挤压泵连续进样，一级质谱全扫描，确定准分子离子。结果显示，4种雌激素在负离子模式下获得准分子离子峰，3种雄性激素和1种孕激素在正离子模式下获得准分子离子。以母离子为准分子离子进行扫描二级质谱，选丰度较高的两个碎片离子作为定性定量离子，并优化对应离子对的去簇电压（Decluste ring potential，DP）、碰撞能（Collision energy，CE）、碰撞室出口电压（Collision cell exit potential，CXP）和碰撞室入口电压（Entrance potential，EP）。综合所有离子对响应信号优化了质谱离子源温度（Temperture，TEM）、碰撞气压（Collision gas，CAD）、气帘气压（Curtain gas，CUR）、雾化气压（GS1）、去溶剂气压（GS2）和离子源喷雾电压（Ion spray voltage，IS）。碰撞室出口电压为15 V，碰撞室入口电压为10 V，主要质谱参数见表1。

3.4 液相色谱条件优化

分别选择乙腈水和乙腈（0.1%甲酸）水（0.1%甲酸）为流动相，选择C18色谱柱，采用不同色谱柱、流动相和流速分析结果。结果表明， YMC Hydrosphere C18色谱柱优于Agilent poroshell C18色谱柱， Hydrosphere柱分离效果、批次重现性、重复性和峰型（窄而无拖尾）均较好，其色谱图如图4； Poroshell柱重复性差，峰型不稳定，批次间响应值差异大，且峰裂较严重。选择YMC柱为分离柱，改变柱温（20，25和30 ℃）对分析物分离效果及响应值的变化影响不大，因此柱溫选择为室温；正离子模式时，流动相加甲酸并没有显著提高分析物的响应信号，乙腈在负离子模式时有利于分析物的去质子化，因此，正负离子模式时流动相选择为乙腈/水；流速分别采用0.2， 0.25和0.3 mL/min，分析结果显示，雌激素在0.25 mL/min时灵敏度高、分离度好，雄激素和孕激素在0.2 mL/min时灵敏度高、分离度好；α雌二醇和β雌二醇、睾酮和表睾酮是差向异构体，异构体的特征离子对相同，所以同时检测两对异构体时仅靠离子的对差异性分不开，因此必须优化液相条件使得差向异构体分开，研究发现，优化的液相条件对两对差向异构体分离度好。

3.5 分析方法的评价

3.5.1 方法的线性范围、检出限和定量限采用基质匹配外标法定量。回归方程的获得是利用浓度范围为1.0～20.0 μg/kg的混合标准溶液，以浓度为横坐标（x， μg/kg）和定量离子对峰面积为纵坐标（y）进行线性回归计算，所得相关系数均大于0.999，线性关系良好。检出限（LOD）和定量限（LOQ）根据信噪比S/N=3和S/N≥10确定，8种类固醇激素的LODs为0.04～0.30 μg/kg，定量限LOQs确定为1.0 μg/kg。

3.5.2 方法的回收率与精密度按照1.0， 2.0， 4.0 μg/kg 浓度水平对空白黄油样品进行添加回收实验，每个添加水平平行测定6次，计算平均加标回收率和相对标准偏差（RSD），回收率为64.1% 110%，相对标准偏差为2.5%～11%（表2）。可见，方法的准确度和精密度符合禁用药物分析技术要求。

3.6 实际样品分析

应用所建方法对4个市售黄油样品进行分析，结果见表3，样品1和样品2中均含有孕酮、表睾酮、雌酮和α雌二醇；样品3和样品4中含有孕酮、表睾酮和雌酮，但除孕酮外，其它激素的含量均小于方法的定量限；4个样品中均未检出β雌二醇、雌三醇、睾酮和丙酸睾酮。4个市售黄油样品中孕酮含量最高，样1，2和4含量相近，范围在127～138 μg/kg，这与文献报道的黄油中孕酮含量值（132.9±5.1） μg/kg相近[28]，样3含量稍高，达180.8 μg/kg，但4个样品中孕酮含量均低于另一文献报道中黄油孕酮含量值300 μg/kg[29]，在4个样品中也检测到雌激素雌酮或α雌二醇，这也与文献[30]报道牛奶中主要雌激素是雌酮和雌二醇一致，本实验与此文献差异为在报道中还检出α雌二醇的差向异构体β雌二醇。很少有报道对牛奶或黄油中雄性激素进行检测，但是曾有研究者在牛奶中检测出睾酮（0.02～

4 结论

建立了黄油中8种类固醇激素的凝胶渗透色谱（GPC）液相色谱/串联质谱（LC MS/MS）检测方法。所建GPC法简化了复杂的样品前处理过程，净化效果好，有效降低了样品中基质对激素检测的干扰，目标物回收率高。应用所建方法对实际动物黄油样品进行检测，结果表明，该方法灵敏度高、重现性好、准确可靠，满足高脂样品中类固醇激素残留量的确证检测要求，对高脂含量样品中药物残留分析具有一定参考意义。

References

1 Krone N， Hughes B A， Lavery G G， Stewart P M， Arlt W， Shackleton C H.J. Steroid Biochem. Mol. Biol.， 2010， 121（3 5）： 496-504

2 Akre C， Fedeniuk R， MacNeil J D.Analyst， 2004， 129（2）： 145-149

3 XIE Wei Ping， OUYANG Yan Ling， HUANG Ying Yu， CHEN Chun Zhu.Chinese Journal of Chromatography， 2010， 28（4）： 388-392

谢维平，欧阳燕玲，黄盈煜，陈春祝. 色谱， 2010， 28（4）： 388-392

4 The Ministry of Agriculture Bulletin of PRC 176， 2002

中华人民共和国农业部公告第176号， 2002

5 The Ministry of Agriculture Bulletin of PRC 193， 2002

中华人民共和国农业部公告第193号， 2002

6 The Ministry of Agriculture Bulletin of PRC 235， 2002

中华人民共和国农业部公告第235号， 2002

7 Scarth J， Clarke A， Hands J， Teale P， Macarthur R， Kay J.Chromatographia， 2009， 71（3 4）： 241-252

8 GAO Hong Yan， MO Bei Hong， JIANG Shi Long， WANG Yin Yu.Chinese Journal of Science and technology of Food Industry， 2009， 30（03）： 364-366

高红艳，莫蓓红，蒋士龙，王荫榆. 食品工业科技， 2009， 30（03）： 364-366

9 LIU Zhi Dong， HUANG Hong Liang， SHEN Jian， GU Jin Hong， OUYANG Jie.Chinese Journal of Academic Periodical of Farm Products Processing， 2012，（10）： 93-97

刘志东，黄洪亮，沈建，顾锦鸿，欧阳杰. 农产品加工（学刊）， 2012，（10）： 93-97

10 Serafeimidou A， Zlatanos S， Laskaridis K， Sagredos A.Food Chem.， 2012， 134（4）： 1839-1846

11 Bhattacharya A， Banu J， Rahman M， Causey J， Fernandes G.J. Nutr. Biochem.， 2006， 17（1）： 789-810

12 Mele M， Contarini G， Cercaci L， Serra A， Buccioni A， Povolo M， Conte G， Funaro A， Banni S， Lercker G， Secchiari P.Int. Dairy J.， 2011， 21（5）： 365-372

13 LUO Jun， YU Jin Yong， CHEN Bing.Chinese Journal of China Dairy Cattle， 2013，（2）： 16-22

罗俊，于进永，陈兵. 中国奶牛， 2013，（2）： 16-22

14 Vanhaecke L， Vanden Bussche J， Wille K， Bekaert K， De Brabander H F.Anal. Chim. Acta， 2011， 700（1 2）： 70-77

15 Marchand P， Bize B， Gade C， Monteau F， André F.J. Chromatogr. A， 2000， 867： 219-233

16 Malone E M， Elliott C T， Kennedy D G， Regan L.J. Chromatogr. B， 2010， 878（15 16）： 1077-1084

17 Wang Q L， Zhang A Z， Pan X， Chen L R.Anal. Chim. Acta， 2010， 678（1）： 108-116

18 ZHANG Ai Zhi， WANG Quan Lin， SHEN Jian， ZHANG Shu Fen， CHEN Li Ren.Chinese Journal of Chromatography， 2010， 28（2）： 190-196

张爱芝，王全林，沈坚，张书芬，陈立仁. 色谱， 2010， 28（2）： 190-196

19 Wang J H， Guo C.J. Chromatogr. A， 2010， 1217（28）： 4732-4737

20 JI Xin Xin， SHI Zhi Hong， CAO Yan Zhong， SHI Li Li， WANG Na， PANG Guo Fang. Chinese Journal of Instrumental Analysis， 2009， 28（12）： 1433-1439

纪欣欣，石志红，曹彦忠，石利利，王娜，庞国芳. 分析测试学报， 2009， 28（12）： 1433-1439

21 XU Xiao Qin.Chinese journal of Shandong University of Technology（Natural Science Edition）， 2011， 25（4）： 74-78

徐晓琴. 山东理工大学学报（自然科学版）， 2011， 25（4）： 74-78

22 Liu J L， Wang R M， Huang B， Lin C， Wang Y， Pan X J.Environ. Pollut.， 2011， 159（10）： 2815-2822

23 Sun H W， Kang Z S， Li H.Chinese J. Anal. Chem.， 2010， 38（9）： 1272-1276

24 SHI Xian Zhe， CAI Bin， HUANG Si Teng， SHAN Yuan Hong， ZHANG Ting Ting， LU Xin， XU Guo Wang.Chinese J. Anal.Chem.， 2013， 41（4）： 517-522

石先哲，蔡斌，黄思腾，单圆鸿，张婷婷，路鑫，许国旺. 分析化学， 2013， 41（4）： 517-522

25 GE Feng， TAN Li Chao， SHAN Zheng Jun， WANG Yi.Journal of Instrumental Analysis， 2011， 30（11）： 1295-1300

葛峰，谭丽超，单正军，王懿. 分析测试学报， 2011， 30（11）： 1295-1300

26 ZHU Wei Xia， LIU Ya Feng， YUAN Ping， YANG Ji Zhou.Chinese Journal of Chromatography， 2010， 28（11）： 1031-1037

祝伟霞，刘亚风，袁萍，杨冀州. 色谱， 2010， 28（11）： 1031-103

27 Hartmann S， Lacorn M， Steinhart H.Food Chem.， 1998， 62（1）： 7-20

28 Ginther O J， Nuti L C， Garcia M C， Wentworth B C， Tyler W J.J. Anim. Sci.， 1976， 42（1）： 155-159

29 Hoffmann B， Hamburger R， Karg H.J. Eur. Food Res. Technol.， 1975， 158（5）： 257-259

30 Erb R E， Chew B P， Keller H F.J. Anim. Sci.， 1977， 45（3）： 617-626

31 Hoffman B， Rattenberger E.J. Anim. Sci.， 1977， 45（3）： 635-647

32 Gaiani R， Chiesa F， Mattioli M， Nannetti G， Galeati G.J. Reprod. Fertil.， 1984， 70（1）： 55-59