液相色谱法测定抗体与对硫磷、异丙威及其竞争原的吸附常数

王鸣华等

摘要：为建立一种测定抗体与小分子化合物吸附性能的色谱分析方法，本研究设计合成了5种对硫磷半抗原和2种异丙威半抗原，将半抗原P1和A1与同一载体蛋白偶联制备“多簇”免疫抗原，免疫动物获得相应的多克隆抗体；采用高效液相色谱结合固相吸附的方法，测定了抗体与对硫磷、异丙威及其竞争原的吸附性能，并通过吸附动力学模型拟合抗体与化合物的吸附行为，获得相应的吸附常数。结果表明抗体与小分子化合物的吸附动力学符合Freundilich模型，抗体与不同化合物的吸附常数为：对硫磷>P1>P4>P3>P2>P5，大小顺序与ELISA亲和常数的测定结果相符，与ELISA灵敏度测定结果有很好的相关性。

关键词：液相色谱； 对硫磷； 异丙威； 竞争原； 抗体； 吸附常数

1引言

基于抗原抗体分子识别的免疫分析技术，特别是酶联免疫吸附分析（Enzymelinked Immunosorbent Assay， ELISA）以特异、灵敏、简便、快速的特点，在农药残留检测中具有独特优势[1]。半抗原、人工抗原、抗体及标记物是小分子免疫分析中的4个基本要素，抗体是核心试剂，而抗体的亲和力（Affinity）是确定抗体性质的重要参数之一，是指抗体与抗原结合的紧密程度，多以亲和常数（Affinity constant）表示[2]。通常采用Beatty等[3]建立的非竞争ELISA法测定抗体的亲和常数，该法不受抗原分子量大小的限制，操作简便易行，结果可靠。但该方法只能测定抗体与包被抗原的亲和力，而不能测定抗体与待测小分子化合物的亲和力。

在竞争ELISA分析方法中，往往异源分析的灵敏度明显高于同源分析[4]，即当抗体与待测化合物的亲和力不变时，抗体与包被抗原的亲和力越弱，待测化合物的竞争能力越强，方法灵敏度就越高。因此，抗体与包被抗原的亲和力强弱不能指导方法建立中包被抗原的筛选，只能合成多种包被抗原后，通过免疫分析结果的评价筛选最佳的包被抗原[5]或利用分子模拟技术对抗体和半抗原进行模拟分析[6]，选择合适的异源半抗原（竞争原）。而这些方法存在一定的盲目性或需要昂贵的设备和专业技术人员。因而，建立一种简便、可靠的能直接比较抗体与竞争原和待测物亲和力强弱的方法，可减少免疫分析中竞争原筛选的盲目性和工作量。

在ELISA测定中，抗体与竞争原的吸附属于固液吸附，而固体液体界面的吸附过程可用Langmiur或Freundilich吸附动力学模型描述，获得的吸附常数可用于表示主体和客体间的亲和力大小[7]。有关利用吸附常数描述抗体与竞争原或待测物亲和力大小的文章尚未见报道。本研究以抗对硫磷和异丙威抗体为例，采用高效液相色谱结合固相吸附的方法，测定“宽谱”抗体对对硫磷、异丙威及其半抗原的吸附能力，通过吸附常数的比较，判断抗体的特性及竞争原的优劣，并与ELISA分析结果相比较，验证了方法的可行性。2实验部分

2.1仪器与试剂

Agilent 1200高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；iMARKTM酶标仪（美国BioRad公司）；DU 800核酸蛋白仪（美国Beckman公司）；Wellwash Plus洗板机（美国Thermo公司）；96孔聚乙烯酶标板（加拿大Jet Biochemical公司）；移液枪（美国Eppendorf 公司）。

对硫磷，异丙威标准品（国家标准物质研究中心）；牛血清蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、二抗（羊抗兔）（SIGMA公司）；碳酸盐缓冲液（CBS，0.05 mol/L，pH 9.6），磷酸盐缓冲液（PBS，0.1 mol/L，pH 7.4）；PBST等缓冲液（实验室配制）；甲醇（色谱纯，美国天地公司）；其它试剂均为分析纯。

2.2半抗原合成

摘要：为建立一种测定抗体与小分子化合物吸附性能的色谱分析方法，本研究设计合成了5种对硫磷半抗原和2种异丙威半抗原，将半抗原P1和A1与同一载体蛋白偶联制备“多簇”免疫抗原，免疫动物获得相应的多克隆抗体；采用高效液相色谱结合固相吸附的方法，测定了抗体与对硫磷、异丙威及其竞争原的吸附性能，并通过吸附动力学模型拟合抗体与化合物的吸附行为，获得相应的吸附常数。结果表明抗体与小分子化合物的吸附动力学符合Freundilich模型，抗体与不同化合物的吸附常数为：对硫磷>P1>P4>P3>P2>P5，大小顺序与ELISA亲和常数的测定结果相符，与ELISA灵敏度测定结果有很好的相关性。

关键词：液相色谱； 对硫磷； 异丙威； 竞争原； 抗体； 吸附常数

1引言

基于抗原抗体分子识别的免疫分析技术，特别是酶联免疫吸附分析（Enzymelinked Immunosorbent Assay， ELISA）以特异、灵敏、简便、快速的特点，在农药残留检测中具有独特优势[1]。半抗原、人工抗原、抗体及标记物是小分子免疫分析中的4个基本要素，抗体是核心试剂，而抗体的亲和力（Affinity）是确定抗体性质的重要参数之一，是指抗体与抗原结合的紧密程度，多以亲和常数（Affinity constant）表示[2]。通常采用Beatty等[3]建立的非竞争ELISA法测定抗体的亲和常数，该法不受抗原分子量大小的限制，操作简便易行，结果可靠。但该方法只能测定抗体与包被抗原的亲和力，而不能测定抗体与待测小分子化合物的亲和力。

在竞争ELISA分析方法中，往往异源分析的灵敏度明显高于同源分析[4]，即当抗体与待测化合物的亲和力不变时，抗体与包被抗原的亲和力越弱，待测化合物的竞争能力越强，方法灵敏度就越高。因此，抗体与包被抗原的亲和力强弱不能指导方法建立中包被抗原的筛选，只能合成多种包被抗原后，通过免疫分析结果的评价筛选最佳的包被抗原[5]或利用分子模拟技术对抗体和半抗原进行模拟分析[6]，选择合适的异源半抗原（竞争原）。而这些方法存在一定的盲目性或需要昂贵的设备和专业技术人员。因而，建立一种简便、可靠的能直接比较抗体与竞争原和待测物亲和力强弱的方法，可减少免疫分析中竞争原筛选的盲目性和工作量。

在ELISA测定中，抗体与竞争原的吸附属于固液吸附，而固体液体界面的吸附过程可用Langmiur或Freundilich吸附动力学模型描述，获得的吸附常数可用于表示主体和客体间的亲和力大小[7]。有关利用吸附常数描述抗体与竞争原或待测物亲和力大小的文章尚未见报道。本研究以抗对硫磷和异丙威抗体为例，采用高效液相色谱结合固相吸附的方法，测定“宽谱”抗体对对硫磷、异丙威及其半抗原的吸附能力，通过吸附常数的比较，判断抗体的特性及竞争原的优劣，并与ELISA分析结果相比较，验证了方法的可行性。2实验部分

2.1仪器与试剂

Agilent 1200高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；iMARKTM酶标仪（美国BioRad公司）；DU 800核酸蛋白仪（美国Beckman公司）；Wellwash Plus洗板机（美国Thermo公司）；96孔聚乙烯酶标板（加拿大Jet Biochemical公司）；移液枪（美国Eppendorf 公司）。

对硫磷，异丙威标准品（国家标准物质研究中心）；牛血清蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、二抗（羊抗兔）（SIGMA公司）；碳酸盐缓冲液（CBS，0.05 mol/L，pH 9.6），磷酸盐缓冲液（PBS，0.1 mol/L，pH 7.4）；PBST等缓冲液（实验室配制）；甲醇（色谱纯，美国天地公司）；其它试剂均为分析纯。

2.2半抗原合成

摘要：为建立一种测定抗体与小分子化合物吸附性能的色谱分析方法，本研究设计合成了5种对硫磷半抗原和2种异丙威半抗原，将半抗原P1和A1与同一载体蛋白偶联制备“多簇”免疫抗原，免疫动物获得相应的多克隆抗体；采用高效液相色谱结合固相吸附的方法，测定了抗体与对硫磷、异丙威及其竞争原的吸附性能，并通过吸附动力学模型拟合抗体与化合物的吸附行为，获得相应的吸附常数。结果表明抗体与小分子化合物的吸附动力学符合Freundilich模型，抗体与不同化合物的吸附常数为：对硫磷>P1>P4>P3>P2>P5，大小顺序与ELISA亲和常数的测定结果相符，与ELISA灵敏度测定结果有很好的相关性。

关键词：液相色谱； 对硫磷； 异丙威； 竞争原； 抗体； 吸附常数

1引言

基于抗原抗体分子识别的免疫分析技术，特别是酶联免疫吸附分析（Enzymelinked Immunosorbent Assay， ELISA）以特异、灵敏、简便、快速的特点，在农药残留检测中具有独特优势[1]。半抗原、人工抗原、抗体及标记物是小分子免疫分析中的4个基本要素，抗体是核心试剂，而抗体的亲和力（Affinity）是确定抗体性质的重要参数之一，是指抗体与抗原结合的紧密程度，多以亲和常数（Affinity constant）表示[2]。通常采用Beatty等[3]建立的非竞争ELISA法测定抗体的亲和常数，该法不受抗原分子量大小的限制，操作简便易行，结果可靠。但该方法只能测定抗体与包被抗原的亲和力，而不能测定抗体与待测小分子化合物的亲和力。

在竞争ELISA分析方法中，往往异源分析的灵敏度明显高于同源分析[4]，即当抗体与待测化合物的亲和力不变时，抗体与包被抗原的亲和力越弱，待测化合物的竞争能力越强，方法灵敏度就越高。因此，抗体与包被抗原的亲和力强弱不能指导方法建立中包被抗原的筛选，只能合成多种包被抗原后，通过免疫分析结果的评价筛选最佳的包被抗原[5]或利用分子模拟技术对抗体和半抗原进行模拟分析[6]，选择合适的异源半抗原（竞争原）。而这些方法存在一定的盲目性或需要昂贵的设备和专业技术人员。因而，建立一种简便、可靠的能直接比较抗体与竞争原和待测物亲和力强弱的方法，可减少免疫分析中竞争原筛选的盲目性和工作量。

在ELISA测定中，抗体与竞争原的吸附属于固液吸附，而固体液体界面的吸附过程可用Langmiur或Freundilich吸附动力学模型描述，获得的吸附常数可用于表示主体和客体间的亲和力大小[7]。有关利用吸附常数描述抗体与竞争原或待测物亲和力大小的文章尚未见报道。本研究以抗对硫磷和异丙威抗体为例，采用高效液相色谱结合固相吸附的方法，测定“宽谱”抗体对对硫磷、异丙威及其半抗原的吸附能力，通过吸附常数的比较，判断抗体的特性及竞争原的优劣，并与ELISA分析结果相比较，验证了方法的可行性。2实验部分

2.1仪器与试剂

Agilent 1200高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；iMARKTM酶标仪（美国BioRad公司）；DU 800核酸蛋白仪（美国Beckman公司）；Wellwash Plus洗板机（美国Thermo公司）；96孔聚乙烯酶标板（加拿大Jet Biochemical公司）；移液枪（美国Eppendorf 公司）。

对硫磷，异丙威标准品（国家标准物质研究中心）；牛血清蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、二抗（羊抗兔）（SIGMA公司）；碳酸盐缓冲液（CBS，0.05 mol/L，pH 9.6），磷酸盐缓冲液（PBS，0.1 mol/L，pH 7.4）；PBST等缓冲液（实验室配制）；甲醇（色谱纯，美国天地公司）；其它试剂均为分析纯。

2.2半抗原合成