大豆油中苯并（a）芘检测方法的优化研究

石全英

摘要：以大豆油为样品，经液-液萃取提取净化后，采用带有紫外检测器的高效液相色谱分析了苯并（a）芘含量，优化了大豆油中苯并（a）芘的检测技术。研究结果表明：该方法线性范围0.10～50 μg/mL （R2=0.9999），检测限3.90 μg/kg，定量限6.09 μg/kg，加标回收率87.90%～98.00%，相对标准偏差1.05%～2.15%。该方法准确、简便、经济，适应于植物油中苯并（a）芘的定性定量测定。

关键词：苯并（a）芘；大豆油；优化；液相色谱

中图分类号： TS225

文献标识码： A 文章编号： 16749944（2015）06026605

1 引言

苯并（a）芘（Benzo（a）pyrene，B（a）P），又称3，4-苯并芘，属于多环芳烃类（PAHs），是一种常见的高活性间接致癌物[1]。近年来，我国出口欧盟和韩国等国家的植物油中多次检测出苯并（a）芘含量超标，2010年“金浩”茶油的超标事件再次敲响食用油安全的警钟[2]。苯并芘可引发肺癌、胃癌、膀胱癌及消化道癌等多种癌症[3，4]，苯并芘还具有致畸性和致突变性，它能通过母体经胎盘影响子代，从而引起胚胎畸形或死亡以及幼仔免疫功能下降[5，6]。

目前，国内外检测植物油中苯并芘的方法主要有：荧光分析法、高效液相色谱法、气质联用、酶联免疫吸附法，以上几种方法灵敏度高[7]。在众多的方法中，高效液相色谱法凭借其分离效率高，选择性好，检测灵敏度高，操作自动化，应用范围广，被国内外研究者广为应用。食用油中苯并（a）的芘检测主要分为样品的前处理和分析两个基本过程。由于植物油中苯并（a）芘具有亲油性，含量极微（多为痕量），稳定性差，较容易吸附，且样品基体成分复杂，存在多种潜在干扰物质，如大量甘油三酯和脂肪物质，影响苯并（a）芘的直接测定。目前，我国检测植物油中苯并芘的国标（GB/T22509-2008）存在着耗时长、操作复杂、回收率不稳定等问题[8]。所以如何快速、准确、简便、经济地检测出植物油中的苯并（a）芘含量，就成为含量分析工作的重点。

本研究针对现存植物油中苯并（a）芘危害因子检测方法的不足，进一步探索了大豆油中苯并（a）芘简便、高效的前处理和检测方法，将对植物油中苯并（a）芘残留进行高效的定性定量分析及食用油安全评估具有重要意义。

2 材料与方法

2.1 原料与试剂

2.1.1 实验材料

一级大豆油，由中粮北海粮油工业（天津）有限公司提供。

2.1.2 实验试剂

乙腈（色谱纯），天津市北科化学品有限责任公司；甲醇（色谱纯），天津市康克德科技有限公司；甲酸（分析纯），天津市风船化学试剂科技有限公司；磷酸（分析纯），天津市北科化学品有限责任公司；二甲基亚砜（分析纯），天津市北科化学品有限责任公司；正己烷（分析纯），天津市北科化学品有限责任公司；氢氧化钾（分析纯），天津市北科化学品有限责任公司；盐酸（分析纯），天津市风船化学试剂科技有限公司。

2.2 主要仪器

ProStar高效液相色谱（配325-LC紫外检测器），美国瓦里安公司； Evolution 300 紫外—可见分光光度计，美国Thermo Scientific公司。

2.3 实验方法

2.3.1 苯并（a）芘检测方法

（1）样品前处理。称取10g大豆油样品，用50mL正己烷分数次溶解，加入90%甲酸提取2次后（每次10mL），加入8%磷酸-二甲基亚砜溶液40mL，振摇2min，静置分层，上层正己烷液中加入40mL二甲基亚砜，弃去上层正己烷溶液，合并两次二甲基亚砜提取液，加入30mL正己烷反提取1次，弃去正己烷洗液。正己烷洗后的二甲基亚砜提取液中加入70mL体积比为1∶1盐酸溶液，振摇2min，后用正己烷提取2次，每次40mL，振摇2min，弃去下层，合并两次正己烷提取液。后用30mL5%氢氧化钾溶液洗1次，蒸馏水洗2次，每次40mL，弃去水层，后于旋转蒸发仪中蒸干，乙腈定容至0.50mL待测。

（2）样品测定。瓦里安（Varian）色谱柱（Microsorb-MV 100-5 C18，250×4.6 mm×1/4"）；柱温30℃；流动相：乙腈-水（88∶12，体积比）；流速1.00mL/min；进样量20μL；检测波长296nm。

2.3.2 色谱条件的优化

（1）检测波长。取苯并（a）芘标准溶液在紫外-可见分光光度计下进行全波长扫描分析，波长范围200～600 nm，得到苯并（a）芘-乙腈溶液紫外吸收光谱图，确定苯并（a）芘-乙腈溶液检测波长。

（2）流动相比例。柱温30 ℃；流速1.00mL/min；进样量20μL；检测波长296nm。流动相比例：乙腈∶水=100∶0～50∶50（体积比），考察流动相比例与样品分离效果的关系，确定流动相最佳比例。

（3）流速。柱温30℃；流动相：乙腈∶水=88∶12（体积比）；进样量20μL；检测波长296nm。在0.60～1.60mL/min范围内改变载液流速，考察载液流速对样品保留时间的影响，确定最佳流速。

2.3.3 苯并（a）芘提取条件的优化

（1）提取溶剂及提取次数的选择。选取正己烷、环己烷、异辛烷作为提取溶剂，分别提取1次、2次、3次，计算苯并（a）芘提取效率，确定最佳提取溶剂及相应提取次数。

（2）磷酸-二甲基亚砜溶液最佳浓度的确定。取一定量的磷酸加入二甲基亚砜中，配制不同浓度（0%、4%、6%、8%、10%、12%）的磷酸-二甲基亚砜溶液。称取1g油样，用5mL正己烷分数次溶解，分别加入不同浓度的磷酸-二甲基亚砜溶液4mL，振摇2min，静置分层，观察破乳效果，确定磷酸-二甲基亚砜溶液最佳浓度。

（3）样品提取液净化方法。称取10g大豆油样品，用50mL正己烷分数次溶解，加入90%甲酸溶液提取2次（每次10mL），洗去提取液中大部分杂质，后按2.3.1方法进行样品处理与含量测定。对照组油样经正己烷溶解后，不经甲酸提取，按2.3.1方法进行操作。对比液相色谱图谱，分析甲酸净化效果。

2.3.4 标准溶液的配制及标准曲线的绘制

准确称取10mg苯并（a）芘标准品，色谱纯乙腈溶解，定容至100mL，此溶液约含苯并（a）芘100μg/kg，作为标准储备液，4℃避光保存。精密吸取贮备液，配制成0.1μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、30μg/mL、50μg/mL苯并（a）芘标准溶液。色谱条件：柱温30℃；乙腈∶水=88∶12（体积比）；流速1.00mL/min；进样量20μL；检测波长296nm。每个浓度平行测定3次，以苯并（a）芘标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，作图得苯并（a）芘的HPLC标准曲线。

2.3.5 HPLC稳定性考察

色谱条件：柱温30℃；流动相：乙腈∶水=88∶12（体积比）；流速1.00mL/min；进样量20μL；检测波长296nm。以0.2μg的苯并（a）芘连续进样10次，分别记录保留时间与峰高，计算保留时间与峰高的相对标准偏差，考察HPLC稳定性。

2.3.6 检测限与定量限

色谱条件：柱温30℃；流动相：乙腈∶水=88∶12（体积比）；流速1.00mL/min；进样量20μL；检测波长296nm。取某一浓度的苯并（a）芘标准品进行色谱分析，对标准品的峰高和噪音的峰高进行多次比较，取平均值，得出3倍和10信噪比时的浓度，即可得出本方法的检测限与定量限。

2.3.7 精密度实验

色谱条件：柱温30℃；流动相：乙腈∶水=88∶12（体积比）；流速1.00mL/min；进样量20μL；检测波长296nm。取苯并（a）芘标准品（10μg/mL）分别于日内和日间（3d）重复进样10次，计算其峰面积平均值、标准偏差（SD）、相对标准偏差（RSD），考察日内精密度和日间精密度。

2.3.8 回收率实验

以不含苯并（a）芘的空白油样中，加入不同量的苯并（a）芘，配置成不同浓度（7μg/kg、15μg/kg、30μg/kg）的苯并（a）芘加标溶液，按2.3.1方法进行样品处理与含量测定，每个浓度作3平行，计算样品回收率及平均相对标准偏差。

W=C1-C2[]C1×100%（1）

式中：W为样品回收率；C1为添加浓度（μg/kg）；C2为实测浓度（μg/kg）。

2.3.9 数据处理

采用SPSS 13.0 软件配对t检验（P≤0.05）和最小显著性差异（LSD）对数据进行整理统计分析。

3 结果与讨论

3.1 色谱条件的优化

3.1.1 检测波长

苯并（a）芘属于多环芳烃类化合物，具有较强的紫外吸收。但关于其最大吸收波长，很多报道都呈现不一致性。陈皓等[9]分别利用高效液相色谱和超高液相色谱在300nm波长下测定土壤中苯并（a）芘的含量。肖莉[10]和汤加云等[11]在波长254nm条件下，分别对沥青烟雾和工业废水中苯并（a）芘的含量进行分析。田晓玲等[12]测定饲料中的苯并（a）芘的含量时，采用已腈-水（75∶25）为流动相，检测波长296nm。

本实验中将苯并（a）芘标准溶液在200～600nm下进行波长扫描，得到苯并（a）芘紫外吸收光谱图。由图1可见，苯并（a）芘-乙腈溶液在296nm处有最大吸收峰。因此，本实验选择296nm作为测定植物油中苯并（a）芘的紫外检测波长。此波长下，测得苯并（a）芘标准色谱图（10μg/mL）见图2。

3.1.2 流动相比例

流动相具有运载样品分子和选择分离的作用，当固定相一定时，流动相的种类和各组分的比例等都严重影响样品的分离效果。当利用紫外检测器测定目标物含量时，应避免选择对紫外光有吸收的溶剂，反相高效液相色谱法测定苯并（a）芘时，常选用作为流动相的溶剂是甲醇和乙腈。当利用紫外检测器检测时，乙腈产生的噪声较小，另外，比较甲醇和乙腈在紫外检测器检测中的梯度基线时发现，色谱级乙腈产生较少鬼峰；考察乙腈和水、甲醇和水的混合液的比率与输液压力的关系时发现，甲醇与水混合产生压力较高，而同样的比例乙腈与水混合，流速一定时不在色谱柱上产生多余的压力；一般情况下，乙腈的洗脱能力强。

综合考虑溶剂的粘度、紫外吸收的强弱、洗脱效果等条件，本方法选取乙腈为流动相。通过改变流动相比例，得到流动相比例与样品分离效果关系，见表1，可以看出，当流动相乙腈与水的比例为88∶12时为测定苯并（a）芘的最佳条件。此流动相比例条件下，样品与苯并（a）芘标准品色谱见图3。

3.2 苯并（a）芘提取条件的优化

3.2.1 提取溶剂及提取次数的选择

进行苯并（a）芘提取时，样品溶剂的选择通常要遵循必须与二甲基亚砜（DMSO）、二甲基亚酰胺（DMF）、硝基甲烷互不相容的原则。因为这三种溶剂对苯并（a）芘或有很强的选择性，借助苯并（a）芘或多环芳烃类物质在两个互不混溶的溶剂中分配系数的不同，反复分配，使苯并（a）芘或多环芳烃类物质从样品溶液中浓缩富集于二甲基亚砜或二甲基亚酰胺液中。

本研究选取苯并（a）芘分析中三种较常见的提取溶剂：正己烷、环己烷、异辛烷，分别进行不同次数的样品分析，结果显示不同提取溶剂与提取次数对苯并（a）芘提取率有明显影响（图4）。当使用环己烷与异辛烷作为提取溶剂时，随着提取次数增多，提取率呈现逐渐上升的趋势，其中样品经过2次提取，已达到90%以上的提取率。当使用正己烷提取2次时，其提取率已达97.22%，为三种溶剂中最高的提取率；之后再增加提取次数，提取率增加并不显著，甚至出现下降的趋势，说明经过3次，苯并（a）芘已基本提取完全，之后的反复提取会造成苯并（a）芘的损失。结合苯并（a）芘提取率与成本因素，本实验选择正己烷为提取溶剂，提取次数为2次。

图4 不同提取溶剂与提取次数对苯并（a）芘提取率的影响

3.2.2 磷酸-二甲基亚砜溶液最佳浓度的确定

弓玉红等[13]报道在二甲基亚砜溶液中加入一定量的磷酸，具有消除混合液中乳化层的作用，且能消除背景物质的干扰。本实验利用不同浓度磷酸-二甲基亚砜溶液（0%～12%）进行样品提取，研究了不同浓度的磷酸-二甲基亚砜溶液对提取液乳化层破坏程度的影响。由图5可以看出，随着磷酸-二甲基亚砜溶液浓度的增加，乳化现象逐渐减轻，当加入8%磷酸-二甲基亚砜溶液时，乳化层基本消失。因此，当磷酸-二甲基亚砜溶液浓度为8%时，即可达到破乳效果。推测当加入磷酸后增加了界面张力，正己烷溶液分层加快。

图5 不同浓度的磷酸＼|二甲基亚砜溶液对提取液乳化层破坏程度

3.2.3 样品提取液净化

过去用柱层、薄层层析或乙酰化纸层析，以达到和其它干扰物的分离，但是步骤繁多，容易造成苯并（a）芘的损失，使回收率不稳定；另外工作量大，检测成本高，因此采用硅胶对样品进行净化处理仍有待进一步探索。

本方法在提取前期，利用甲酸溶液将提取液中大部分杂质洗去，即可达到一定的净化效果。由图6可以看出，不经过甲酸处理的样品在色谱图上出现了大量杂峰，杂峰峰高较大，且有少量苯并（a）芘；经甲酸净化的样品，杂峰明显减少，部分杂峰峰高显著降低，峰形改善。

3.3 标准曲线

实验结果表明，苯并（a）芘含量与峰面积的线性范围为0.10～50μg/mL；回归方程为y=3.1999x-0.1897（y为峰面积；x为浓度，μg/mL），相关系数为R2=0.9999，线性关系良好。标准曲线见图7。

图7 苯并（a）芘含量与峰面积关系标准曲线

3.4 HPLC稳定性考察

在选定的最佳色谱条件下，以0.20μg的苯并（a）芘连续进样10次，分别记录保留时间与峰高。结果显示（表2），保留时间和峰高的均值分别为12.87min和121.14mAU；相对标准偏差分别为0.32%和1.75%，表明仪器有着良好的稳定性和精密度。

3.5 检测限与定量限

本实验以3倍噪音比来确定检测限，10倍噪音比来确定定量限。进空白样，以基线3倍和10倍噪声值在标准曲线查得结果并计算，得到本方法的检测限为3.90μg/kg，定量限为6.09μg/kg，实验结果表明本方法的灵敏度较高，能满足实际测定的要求。

3.6 精密度实验

本实验在选定的最佳色谱条件下，取苯并（a）芘标准品（10μg/mL）分别于日内和日间（3d）重复进样10次，考察日内精密度和日间精密度。结果如表3所示，日内峰面积标准偏差和相对标准偏差分别为0.18，1.82%；日间峰面积标准偏差和相对标准偏差分别为0.28，2.74%，表明本方法的精密度良好。

3.7 回收率实验

本实验以不含苯并（a）芘的空白油样为样品，设计7μg/kg、15μg/kg、30μg/kg三个添加浓度，计算不同浓度苯并（a）芘的回收率，考察方法的准确度，结果见表4。从表4中可看出，样品浓度为7μg/kg、15μg/kg、30μg/kg时，样品平均回收率为87.90%、97.73%、98.00%，平均相对标准偏差（RSD）分别为2.15%、1.99%、1.05% （n=3），表明该方法具有较高准确度，能满足分析要求。

4 结论

本研究优化了大豆油中苯并（a）芘测定技术，大豆油样品经90%甲酸净化，后经正己烷、8%磷酸-二甲基亚砜溶液等萃取及反萃取纯化，经HPLC分离苯并（a）芘，采用紫外检测器测定其含量。对苯并（a）芘测定的提取条件进行优化，有效避免提取过程中乳化现象的产生，简化了样品提取液净化过程，操作简单、快速，便于掌握；同时，该方法采用液液分配及紫外检测器分析样品，使分析成本大大降低。方法线性范围0.10～50μg/mL（R2=0.9999），检测限3.90μg/kg，定量限6.09μg/kg，加标回收率87.90%～98.00%，相对标准偏差1.05%～2.15%。该方法准确、简便、经济，适应于植物油中苯并（a）芘的定性定量测定。

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