宫颈癌及癌前病变组织中含HPV16 E7基因转录本分析*

季红薇, 朱 华, 林 丛, 张文淼, 陈 俊, 朱雪洁△, 邹阮敏△

(1丽水市中心医院妇产科， 浙江 丽水 323000； 2温州医科大学附属第一医院妇产科， 浙江 温州 325000； 3温州医科大学微生物与免疫学教研室， 浙江 温州 325035)

宫颈癌是全世界引起女性死亡的第2大肿瘤。高危型人乳头瘤病毒(human papillomaviruses, HPV)持续感染是引起宫颈癌的重要原因[1]。目前常见的高危型HPV有HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58和59[1]，其中，50%以上的宫颈癌与HPV16感染相关[2]。现已经明确，HPV基因整合是促进宫颈癌发生的另一重要因素[3-4]。HPV DNA整合使病毒重要调控基因E2断裂，HPV的E6和E7癌基因与宿主基因组一起转录表达，促进E6和E7癌蛋白表达[5]。E6能结合并灭活抑癌蛋白p53， E7能结合并泛素化降解抑癌蛋白pRb，这2种重要的细胞抑癌蛋白被降解是高危型HPV参与宫颈癌发生发展的重要机制[6-7]。虽然HPV16早期基因转录模式近几年已有相关的报道，但迄今尚未见系统分析宫颈癌发生发展过程中的E7相关转录模式。因此，本研究通过扩增癌基因转录本的方法检测HPV16阳性的宫颈组织样本[包括低度鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesion, LSIL)组织、高度磷状上皮内病变(high-grode squamous intraepithelial lesion, HSIL)组织和宫颈癌(cervical cancer, CxCa)组织]中HPV16E7相关转录模式，探讨宫颈癌发生发展过程不同病变时期E7相关转录本的变化。

材 料 和 方 法

1 临床标本

53例HPV16阳性宫颈组织标本(包括15例LSIL、20例HSIL和18例CxCa)收集自温州医科大学附属第一医院2016年12月～2018年3月期间门诊及住院患者，年龄范围25～59岁，中位数为43岁。所有患者术前均未进行放、化疗等治疗，收集的标本均经病理科确诊。同时收集9例HPV阴性正常宫颈组织作为对照。本研究使用的临床样本已经由患者知情以及医院伦理委员会同意。每例标本离体后10 min内放入RNAlater保存待后续实验。

2 试剂

RNAlater购自Ambion；TRIzol试剂购自Invitrogen；RNase-free DNase I 试剂盒购自TaKaRa；RT-PCR试剂盒和KOD -Plus- PCR试剂盒购自TOYOBO；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京天根生物科技有限公司；T载体试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；Southern检测试剂盒(North2South Chemiluminescent Detection Kit)购自Thermo；生物素-亲和素化学发光试剂盒购自Pierce。引物合成和测序由上海生物工程有限公司完成。

3 方法

3.1RNA提取 取RNAlater保存的宫颈组织样本，按照TRIzol试剂的说明书分离RNA。为排除残余DNA污染，按DNase I试剂盒说明书提纯RNA，溶解于RNase-free 水，采用NanoDrop 2000C超微量分光光度计(Thermo)检测RNA浓度，采用Agilent 2100生物芯片分析系统测定RNA纯度。

3.2HPV16E7转录本的扩增 参考文献[8]进行HPV16E7转录本的扩增(即乳头瘤病毒癌基因转录本扩增，amplication of papillomavirus oncogen transcripts, APOT)，引物序列见表1。按照RT-PCR试剂盒说明书，1 μg总RNA以含ployT17(17个T结尾)及通用序列的RT引物进行逆转录。cDNA产物以HPV16E7特异性引物(P1)和通用引物(P0)分别作为PCR的正向和反向引物，PCR扩增HPV16E7转录本。50 μL反应体系含:1.0 mmol/L MgSO4, 0.2 mmol/L dNTPs, 0.2 μmol/L P1、P0，1.0 单位高保真酶(KOD -Plus-)。反应条件为：95 ℃ 90 s预变性，94 ℃ 30 s变性，59 ℃ 30 s退火，68 ℃ 2 min延伸，35个循环，68 ℃ 6 min最终延伸(保证扩增片段的完整性)。

表1 HPV16 E7转录本检测相关引物的序列

3.3HPV16E7转录本Southern blot检测 HPV16E7转录本PCR产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳，切去边缘多余部分，置于200 mL变性液中，浸泡45 min，使凝胶上的双链DNA转变为单链DNA，用去离子水冲洗凝胶2次，然后将凝胶中的DNA通过湿转的方法原位转移到硝酸纤维素膜上， 80 ℃干燥2 h，紫外交联固定。按Southern blot检测试剂盒说明书，用生物素标记的HPV16E6特异性探针(5’-bCAGCTACACCTACAGGCAACAACAA-3’，b代表生物素标记)55 ℃杂交过夜，洗膜。最后采用生物素-亲和素化学发光试剂盒检测。

3.4HPV16E7转录本序列分析 PCR产物电泳后，回收琼脂糖凝胶中不同的PCR产物。参照T载体试剂盒说明书，将回收片段连到T载体上，挑单克隆，PCR鉴定后，进行测序，BLAST比对HPV16参考基因组序列(GenBank ID：K02718)获得转录本中的病毒基因序列，BLAST比对NCBI中人参考基因组(GRCH38)获得宿主基因序列。

结 果

1 宫颈癌HPV16 E7转录本APOT检测

与LSIL组织比较，HSIL及CxCa组织存在更加复杂、多样的E7基因转录本，但未见特征的转录本，见图1。

Figure 1. APOT assay was used to detect HPV16E7-related transcripts. A: transcripts in LSIL; B: transcripts in HSIL; C: transcripts in cervical cancer tissues. M: marker.

图1 APOT检测LSIL、HSIL及宫颈癌组织中HPV16E7相关的转录本

2 HPV16 E7转录模式分析

经上述建立的方法扩增转录本片段，连接T载体，经测序以及序列比对分析后，得到5种HPV16E7的转录模式，并绘制模式图，见图2。模式A和B均以E7-E1开始，其中模式A的病毒基因直接以polyA结尾，E1基因的3’端有4种断裂位点，分别在nt880、nt949、nt1054和nt1234；而模式B中病毒基因与宿主序列发生整合，其E1基因的3’端有2种剪切位点，分别为nt880和nt1107；模式C和模式D中都包含了病毒基因序列和宿主基因序列,属于典型的整合型转录本。模式C中SD880与SA2709剪接，E2基因3’端的nt2870与宿主基因整合；模式D中SD880与SA3358剪接，E4基因3’端的nt3619位点与宿主基因整合。模式E与模式D类似，也有SD880-SA3358的剪切形式，并且还有E4-L1之间的晚期基因剪切SD3632-SA5639，见图3。

3 HPV16 E7转录模式在各病理级别的宫颈组织中的比例

HPV16E7的5种转录模式在不同癌变程度的宫颈组织中存在较大的差异。本研究发现，模式A与B在所有HPV16阳性的宫颈组织中都能检测到，并且主要在HSIL组织中，分别占61.5%和72.9%。模式C绝大多数在宫颈癌组织中检测到，占88.9%，其次主要位于HSIL组织，见图4。

4 含E4序列HPV16 E7转录本在宫颈癌组织中表达

通过E4特异性探针的Southern blot验证模式D和E在宫颈癌组织中的表达。如图5所示，部分标本(如3、4、8、9、14等标本)未能检测到含E4转录本，且不同宫颈癌标本检测的含E4转录本也存在明显差异条带。

Figure 2.Five transcript pattern diagrams related to HPV16E7. §： in pattern A, there were 4 cleavage sites of theE1gene, nt880, nt949, nt1054, and nt1234; ▲: in model B, there were 2 cleavage sites for theE1gene, nt880 and nt1107.

图2 HPV16E7相关的5种转录本模式图

Figure 3.Altenative splicing sequence characteristics of types C, D and E in HPV16E7transcripts.

图3 HPV16E7转录本C、D、E模式可变剪切序列特征

讨 论

持续性感染高危型HPV会导致病毒拷贝量在宿主细胞中累积，同时病毒癌性基因的转录模式也会向有利于肿瘤细胞增殖的方向发展。因此，不同恶变程度的宫颈肿瘤细胞，HPV转录模式也会不同。与大多数病毒基因组类似，HPV基因属于双顺反子或多顺反子，基因转录后未成熟的mRNA一般通过剪切加工才能变成成熟的mRNA[9]，这种RNA的选择性剪切机制对于病毒基因的表达具有重要意义。不同的RNA剪切会产生不同的转录模式，因此表达的蛋白也会不同。目前也有不少研究者采用人乳头瘤病毒癌基因扩增的方法检测游离型和整合型的病毒癌基因转录模式[8-9,14]，但是这种巢式PCR的检测方法存在一定局限，它无法有效扩增由病毒基因和整合基因构成的融合型长序列的转录本，导致检测的整合型转录本数少于实际的数量。另外，这种方法倾向于扩增本底mRNA浓度高、转录本数量多的转录模式而忽略本底量少的转录模式[14]。因此，我们通过优化检测方法避免人为增强高含量转录本的扩增优势，使检测结果更客观。

Figure 4.Proportion of the 5 transcriptional modes of HPV16E7in cervical tissues at various pathological levels.

图4 HPV16E75种转录模式在各病理级别宫颈组织中所占的比例

Figure 5.Southern blot analysis of HPV16E7transcript expression in cervical cancer tissues. Lanes 1～15 represent the specimens of cervical cancer tissue No.1～15, respectively.

图5 Southern blot检测HPV16E7转录本在宫颈癌组织中表达

近年已有HPV16早期基因转录模式的报道[8,10]，例如，E6的游离型转录本E6-E7-E1^E4和整合型转录本E6-E7-E1^cellular DNA、E6-E7-E1^E4- cellular DNA、E6-E7-E1-cellular DNA等；E7的游离型转录本E7-E1^E4和一些整合型的转录本E7-E1^cellular DNA、E7-E1^E4-cellular DNA等。HPV16E7早期基因转录模式在宫颈癌发生发展过程中的变化，迄今尚未阐明。本研究显示HPV16E7早期基因转录模式在宫颈癌变各时期中存在很大差异。在5种HPV16E7转录模式中，除了已经报道的转录模式B和D[10]，转录模式A、C和E是首次发现，其中转录模式B、C、D和E属于融合型，模式A属于游离型。我们发现在一些宫颈癌样本中甚至包含了所有5种检测到的转录本，提示游离型和整合型的转录模式在高度癌变的宫颈组织中可以同时存在[8]。HPV16E7的转录模式在宫颈癌变各时期中的差异都较大,模式D和E只在宫颈癌中检测到，而模式A和B却在所有类型的癌变宫颈组织中都能检测到。这些结果进一步证明转录模式的选择是一个动态的过程[15]。为了促使宿主细胞能克服变化的环境带来的不利因素而不断地增殖，病毒基因组会选择最优的基因表达模式，这就容易理解:随着细胞癌变程度的加深,病毒的某些特定转录模式会逐渐增多而形成优势转录。