Trx-1过表达通过NF-κB信号通路减轻MPP+所致PC12细胞的氧化应激损伤*

陈伟巍， 王 敏， 吴明辉

(湖北江汉油田总医院神经内科， 湖北 潜江 433124)

帕金森病是一种发病率仅次于阿尔茨海默病的中枢神经系统变性疾病，其发病机制除了与遗传、年龄、脑中路易小体沉积和黑质多巴胺神经元退行性变有关外，还与氧化应激关系密切。氧化应激损伤被认为是帕金森病发病的重要环节[1-2]。神经元进行性丢失被认为是神经退行性疾病的重要病理特征，而氧化应激在促进神经细胞凋亡过程中发挥着重要作用。神经元中含有较低的抗氧化活性的谷胱甘肽和较丰富的对自由基敏感的多不饱和脂肪酸，使其清除自由基能力减弱而遭受自由基攻击能力增强。因此，减轻氧化应激对神经元细胞损伤是控制和治疗帕金森病发生发展的重要策略。硫氧还蛋白1(thioredoxin 1，Trx-1)是一种广泛分布于生物体内的抗氧化蛋白，通过巯基-二硫键相互转换在维持和调节细胞的氧化还原过程中发挥着重要作用；核因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)是细胞内重要的核转录因子，通过调控下游多种基因的表达参与细胞的生长发育、炎症反应、免疫调节和细胞凋亡等过程，与包括帕金森病在内的多种神经系统疾病的发生关系密切[3-4]。已有研究[5-7]发现，Trx-1可通过增强DJ-1基因的表达调节帕金森病中的自噬和内质网应激反应，Trx-1可调控NF-κB活性参与细胞的氧化应激过程，但Trx-1通过NF-κB信号通路调控帕金森病氧化应激损伤的机制并不明确。1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+)是一种可引起神经细胞氧化应激损伤的神经毒，作为氧化应激损伤细胞模型的诱导剂[8-9]被用于研究帕金森病的发病机制。本研究以大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞为研究对象，通过MPP+刺激构建氧化应激损伤细胞模型，观察Trx-1通过NF-κB信号通路对氧化应激损伤的影响，以期为帕金森病的发生发展机制及治疗提供新的线索。

材 料 和 方 法

1 主要材料

大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞株购自中国上海典型培养物储备中心。MTT试剂(批号：M2128)和MPP+(批号：D048)购自Sigma；胎牛血清(批号：SH41289)购自Gibco-Brl；高糖DMEM培养基(批号：SH30022.01C)购自HyClone；抗NF-κB p65抗体(批号：2459)和抗IκB-α抗体(批号：3465)购自美国凯基生物公司；RIPA裂解液(批号：P0013C)购自上海碧云天生物研究所；抗p-IκBα抗体(批号：ab7219)和抗p-NF-κB p65抗体(批号：ab95022)购自Abcam；抗β-actin抗体(批号：160916)购自Santa Cruz；辣根过氧化酶标记的 II 抗(批号：160915)购于北京中杉金桥公司；丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量检测试剂盒(批号：20150816)、超氧化物歧化酶(super-oxide dismutase, SOD)活力检测试剂盒(批号：20150722)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)活力检测试剂盒(批号：20150713)购于南京建成有限公司。

2 方法

2.1细胞培养 采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基于37 ℃、 5% CO2条件的细胞培养箱中常规培养PC12细胞, 选取第4代对数生长期细胞进行实验。

2.2氧化应激损伤细胞模型的建立 将PC12细胞以每孔5×104个种植于96孔细胞板上，将其随机分为control组(加入等量培养液)、1 mmol/L MPP+组(加入浓度为1 mmol/L的MPP+)、3 mmol/L MPP+组(加入浓度为3 mmol/L的MPP+)和5 mmol/L MPP+组(加入浓度为5 mmol/L的MPP+)。置于细胞培养箱内常规培养过夜。采用MTT法检测细胞活力，试剂盒检测细胞上清液中LDH和SOD的活性及MDA含量。后期，将PC12细胞随机分为control组(加入等量培养液)、3 mmol/L MPP+组(加入浓度为3 mmol/L的MPP+)和3 mmol/L MPP++佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)组(加入浓度为3 mmol/L的MPP+和NF-κB激活剂PMA)，经MPP+和PMA作用24 h后，采用MTT法检测细胞活力，试剂盒检测细胞上清液中LDH和SOD的活性及MDA含量。

2.3MTT法检测细胞活力 将MPP+处理24 h后的PC12细胞以每孔3×104个接种至96孔细胞板上，孵箱内培养24 h后，每孔加入20 μL MTT试剂(浓度为5 g/L)作用24 h。弃培养液，加入二甲基亚砜充分溶解MTT结晶。上酶标仪检测各组细胞在490 nm处的吸光度(A)值。以药物组A均值与对照组A均值的百分比计算各组细胞的相对活力。

2.4细胞上清液中LDH和SOD活性及MDA含量的检测 收集培养结束的PC12细胞上清液，根据试剂盒说明书步骤分别检测LDH和SOD活性及MDA含量。

2.5Western blot检测蛋白水平 采用RIPA细胞裂解液提取PC12细胞的总蛋白，并采用BCA法定量总蛋白。向蛋白样品中加入等体积的上样缓冲液于沸水浴中变性3～5 min后，采用微量加样器以每孔50 μg蛋白样品上样至SDS-PAGE凝胶孔中行分离。待电泳结束后电转至PVDF膜上。以脱脂奶粉浓度为5%的TBST溶液封闭1 h后，加入封闭液稀释的 I 抗(1∶1 000)于4 ℃下孵育24 h。弃培养液后，采用封闭液洗涤10 min，洗涤3次后，加入封闭液稀释的 II 抗(1∶2 000)于37 ℃下孵育1 h。封闭液再次洗涤后，加入化学发光剂暗室内显影曝光，凝胶成像系统扫描分析。

2.6慢病毒感染 将对数生长期的PC12细胞以每孔1×105个细胞接种至6孔细胞板上，将其随机分为control组(加入等量培养液)、3 mmol/L MPP+组(加入3 mmol/L MPP+作用48 h)、3 mmol/L MPP++NC组(Ad-GFP空载体的阴性对照慢病毒感染24 h后，加入3 mmol/L MPP+作用24 h)和3 mmol/L MPP++ Trx-1组(以含Ad-Trx-1-GFP序列的慢病毒感染24 h后，加入3 mmol/L MPP+作用24 h)，于培养箱中培养至60%融合度时更换培养液，加入6 mg/L polybrene，并按照实验分组以MOI=10加入慢病毒进行感染。其中，Ad-GFP空载体的阴性对照慢病毒和含Ad-Trx-1-GFP 序列的慢病毒载体是由武汉转导生物实验室设计完成，慢病毒载体系统购于上海吉凯基因公司。感染48 h后，分别采用Western blot检测细胞中Trx-1、NF-κB p65、IκBα、p-NF-κB p65和p-IκBα的蛋白水平，MTT法检测细胞的存活率，试剂盒检测细胞上清液中LDH和SOD活性及MDA含量。后期实验另设3 mmol/L MPP++ Trx-1+吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)组(以含Ad-Trx-1-GFP序列的慢病毒感染24 h后，加入3 mmol/L MPP+和NF-κB信号通路抑制剂PDTC作用24 h)，经慢病毒感染和给药处理结束后，采用MTT法和试剂盒分别检测细胞存活率和细胞上清液中LDH和SOD活性及MDA含量。

3 统计学分析

采用SPSS 22.0进行统计学分析。实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较使用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 MPP+对PC12细胞氧化应激的影响

浓度为1、3和5 mmol/L的MPP+处理PC12细胞24 h后，与control组相比,PC12细胞的活力和细胞上清液中SOD的活性明显降低，而细胞上清液中的LDH活性和MDA含量明显升高(P<0.05)；且3 mmol/L MPP+和5 mmol/L MPP+的作用明显大于1 mmol/L MPP+(P<0.05)，而3 mmol/L MPP+和5 mmol/L MPP+组间差异无统计学显著性(P>0.05)，见表1。故后期采用3 mmol/L MPP+进行实验。

表1 MPP+对PC12细胞活力、上清液中LDH和SOD活性及MDA含量的影响

Table 1.The effect of MPP+on the cell viability, the activity of LDH and SOD, and MDA content in the culture supernatant of PC12 cells (Mean±SD.n=3)

GroupCell viability (%)LDH (×103U/L)MDA (μmol/L)SOD (×103 U/L)Control100.00±10.0934.40±4.6012.75±1.1346.70±3.231 mmol/L MPP+82.60±7.30∗49.60±5.50∗17.31±1.24∗38.32±2.25∗3 mmol/L MPP+51.20±6.10∗#78.20±6.40∗#27.57±1.55∗#27.13±2.31∗#5 mmol/L MPP+48.70±6.80∗#83.10±6.80∗#29.73±1.79∗#25.34±2.36∗#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs1 mmol/L MPP+group.

2 MPP+对PC12细胞中Trx-1蛋白表达的影响

不同浓度(1、3和5 mmol/L)的MPP+刺激PC12细胞后，Trx-1蛋白的表达较control组明显降低(P<0.05)；且3 mmol/L MPP+组和5 mmol/L MPP+组细胞中Trx-1蛋白的表达水平明显低于1 mmol/L MPP+组，而3 mmol/L MPP+组和5 mmol/L MPP+组间的差异无统计学显著性(P>0.05)，见图1。

Figure 1.The protein expression of Trx-1 in PC12 cells was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs1 mmol/L MMP+group.

图1 Western blot检测PC12细胞中Trx-1蛋白的表达结果

3 Trx-1过表达对PC12细胞氧化应激的影响

Western blot结果显示，3 mmol/L MPP+组细胞中Trx-1蛋白的表达水平明显低于control组(P<0.05)，3 mmol/L MPP++ Trx-1组明显高于3 mmol/L MPP+组(P<0.05)，而3 mmol/L MPP++ NC组与3 mmol/L MPP+组间的差异无统计学显著性(P>0.05)，见图2、表2。与control组相比，3 mmol/L MPP+能够明显降低PC12细胞的活力和细胞上清液中SOD的活性(P<0.05)，且显著升高细胞上清液中LDH活性和MDA含量(P<0.05)；与3 mmol/L MPP+组相比，3 mmol/L MPP++ Trx-1组细胞的活力和SOD活性显著升高(P<0.05)，而LDH活性和MDA含显著降低(P<0.05)；3 mmol/L MPP++ NC组与3 mmol/L MPP+组间细胞活力、LDH活性、SOD活性和MDA含量的差异无统计学显著性(P>0.05)，见表2。

Figure 2.The infection efficiency of lentivirus was detected by Western blot.

图2 Western blot检测慢病毒的感染效率

4 Trx-1过表达对PC12细胞中NF-κB信号通路的影响

Western blot结果显示，各组PC12细胞中NF-κB p65和IκBα蛋白表达的差异均无统计学显著性(P>0.05)；3 mmol/L MPP+组细胞中p-NF-κB p65和p-IκBα的蛋白水平均明显高于control组(P<0.05)，3 mmol/L MPP++Trx-1组中p-NF-κB p65和p-IκBα的蛋白水平较3 mmol/L MPP+组明显降低(P<0.05)，而3 mmol/L MPP++NC组与3 mmol/L MPP+组间的差异无统计学显著性(P>0.05)，见图3、表3。

表2 Trx-1过表达对MPP+刺激下PC12细胞的活力、 上清液LDH和SOD活性及MDA含量的影响

Table 2.The effect of Trx-1 over-expression on the cell viability, and the supernatant LDH and SOD activity and MDA content of the PC12 cells under MPP+stimulation (Mean±SD.n=3)

GroupTrx-1 expressionCell viability (%)LDH (×103 U/L)MDA (μmol/L)SOD (×103 U/L)Control1.00±0.12100.00±11.3034.40±4.6012.75±1.1346.70±3.233 mmol/L MPP+0.63±0.05∗50.60±6.40∗76.50±6.80∗24.51±1.35∗28.45±2.71∗3 mmol/L MPP++ NC0.68±0.06∗52.30±5.40∗75.10±7.20∗25.30±1.48∗27.64±2.94∗3 mmol/L MPP++ Trx-11.74±0.14∗#82.30±7.56∗#57.18±5.40∗#19.11±1.43∗#37.16±2.38∗#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs1 mmol/L MPP+group.

Figure 3.The protein levels of NF-κB signaling pathway-related molecules detected by Western blot.

图3 Western blot检测NF-κB信号通路相关蛋白的水平

5 NF-κB信号通路对PC12细胞氧化应激的影响

与control组相比，3 mmol/L MPP+组和control+ PMA组细胞的活力和SOD活性均明显降低(P<0.05)，而LDH活性和MDA含量均明显升高(P<0.05)；给予100 μg/L NF-κB信号通路激活剂PMA处理后，明显增强了MPP+对PC12细胞活性的抑制作用并加重了细胞的氧化应激损伤(P<0.05)，见表4。

6 Trx-1通过NF-κB信号通路减轻MPP+对PC12细胞的氧化应激损伤

3 mmol/L MPP+组细胞的活力和SOD活性明显低于control组(P<0.05)，LDH活性和MDA含量则明显高于control组(P<0.05)；给予100 μmol/L NF-κB信号通路抑制剂PDTC或Trx-1过表达后，MPP+对PC12细胞的上述作用均明显减弱(P<0.05)；同时，给予PDTC后，Trx-1过表达恢复MPP+刺激下PC12细胞的活力和减轻氧化应激损伤的作用明显增强(P<0.05),见表5。

讨 论

本研究中以1、3和5 mmol/L MPP+处理大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞24 h后，PC12细胞的存活率和细胞上清液中SOD活性明显降低，而细胞上清液中LDH活性和MDA含量明显升高。 SOD是一种可将超氧阴离子转化为过氧化氢的抗氧化酶，其活力的高低可间接反映机体清除自由基的能力大小；MDA是一种脂质过氧化物，其含量的高低可间接反映机体遭受自由基攻击的程度；LDH是活细胞胞浆内酶，在细胞损伤时，细胞膜通透性发生改变使LDH释放到培养液中，细胞液中LDH活性大小可较好地反映出细胞膜的损伤程度；三者常被作为反映细胞氧化应激的重要指标[10-11]。 结果表明MPP+对PC12细胞有一定的毒性，并诱导PC12细胞的氧化应激损伤。

表3 Trx-1过表达对MPP+刺激下PC12细胞中NF-κB信号通路相关蛋白水平的影响

Table 3.The effect of Trx-1 over-expression on the protein levels of NF-κB signaling pathway-related molecules in the PC12 cells stimulated with MPP+(Mean±SD.n=3)

Groupp-NF-κB p65NF-κB p65p-IκBαIκBαControl1.00±0.081.00±0.071.00±0.111.00±0.083 mmol/L MPP+1.89±0.15∗0.94±0.091.48±0.13∗0.94±0.103 mmol/L MPP++NC1.81±0.14∗0.97±0.081.52±0.17∗1.35±0.15∗3 mmol/L MPP++Trx-11.31±0.12∗#1.05±0.110.76±0.06∗#1.25±0.14

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs3 mmol/L MPP+group.

表4 PMA对MPP+刺激下PC12细胞活力、上清液LDH和SOD活性及MDA含量的影响

Table 4.The effect of PMA on cell viability, the activity of LDH and SOD, and MDA content in the culture supernatant of PC12 cells with MPP+stimulation (Mean±SD.n=3)

GroupCell viability (%)LDH (×103 U/L)MDA (μmol/L)SOD (×103 U/L)Control100.00±9.2031.40±4.1013.75±1.5744.78±3.33Control+PMA63.31±8.22∗54.76±7.81∗21.83±2.39∗23.79±2.14∗3 mmol/L MPP+49.60±6.10∗78.50±6.50∗25.51±1.48∗27.18±2.64∗3 mmol/L MPP++PMA28.70±9.56#96.18±5.80#33.11±1.54#18.12±2.51#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs3 mmol/L MPP+group.

表5 Trx-1调控NF-κB信号通路对PC12细胞活力、上清液中LDH和SOD活性及MDA含量的影响

Table 5.The effects of Trx-1-regulated NF-κB signaling pathway on the cell viability, LDH, SOD activities and MDA content in the culture supernatant of PC12 cells with MPP+stimulation (Mean±SD.n=3)

GroupCell viability (%)LDH (×103 U/L)MDA (μmol/L)SOD (×103 U/L)Control100.00±12.0332.19±4.6012.47±1.1345.47±3.073 mmol/L MPP+51.70±5.6075.58±5.8023.58±1.3526.24±2.533 mmol/L MPP++PDTC65.42±5.71∗66.24±6.19∗19.49±1.88∗35.07±3.28∗3 mmol/L MPP++NC49.50±5.1077.61±7.3026.17±1.4224.37±2.673 mmol/L MPP++Trx-162.20±7.83#63.45±5.40#18.51±1.43#38.64±2.21#3 mmol/L MPP++Trx-1+PDTC75.16±6.13&48.81±7.27&10.11±2.17&43.36±2.04&

*P<0.05vs3 mmol/L MPP+group;#P<0.05vs3 mmol/L MPP++NC group;&P<0.05vs3 mmol/L MPP++Trx-1 group.

本研究以1、3和5 mmol/L MPP+处理后，PC12细胞中Trx-1的表达明显受到抑制，提示Trx-1可能在帕金森病的发生发展中发挥着重要作用。通过构建含Ad-Trx-1-GFP序列的慢病毒载体成功上调Trx-1表达后，3 mmol/L MPP+引起的PC12细胞存活率和SOD活性的降低以及LDH活性和MDA含量的升高这一系列变化均明显减弱。Trx-1是一种分子量为12 kD的多功能蛋白，广泛分布于原核和真核生物中，可催化蛋白质二硫键和巯基的转换，常作为抗氧化剂参与细胞的氧化还原反应[12-13]。Trx-1表达的骨髓间充质干细胞可通过下调TGF-β表达减轻博莱霉素诱导的硬皮病皮肤纤维化和氧化应激[14]；Trx1可通过维持Prdx的表达来抑制星形胶质细胞的氧化应激，从而发挥神经保护作用[15]；此外，上调Trx-1表达可降低活性氧的产生，增加抗氧化防御能力，进而减轻葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎[16]。结果表明Trx-1过表达可减轻MPP+诱导的PC12细胞氧化应激损伤。结果提示，Trx-1在帕金森病的发生和发展过程中可通过增强抗氧化应激能力发挥神经保护作用。

采用NF-κB信号通路激活剂PMA处理PC12细胞后，MPP+诱导的PC12细胞氧化应激损伤明显加重；而给予NF-κB信号通路抑制剂PDTC处理PC12细胞后，Trx-1过表达对MPP+诱导的PC12细胞氧化应激损伤的改善作用明显增强。氧化应激反应涉及到多种信号通路的调控，NF-κB信号通路就是其中之一。NF-κB是一种研究较多的核转录因子，正常情况下以无活性的p65/p50/IκBα三聚体复合物存在，其中IκBα是NF-κB抑制蛋白，当细胞受到氧化应激或炎症因子刺激时，IκBα磷酸化降解释放p65/p50二聚体进入细胞核，激活下游相关基因，进而参与调控细胞凋亡、炎症反应和免疫应答等[17-18]。NF-κB信号通路激活可通过调控凋亡相关蛋白如Bcl-2、p53和Par-4等的表达诱导神经元细胞凋亡，造成细胞损伤，与帕金森病的发生和发展关系密切[19-20]。结果表明，在MPP+诱导的PC12细胞氧化应激损伤过程中，NF-κB信号通路被激活，而Trx-1过表达可通过抑制NF-κB信号通路的活化减轻MPP+诱导的PC12细胞氧化应激损伤。

综上所述，Trx-1可抑制NF-κB信号通路增强细胞的抗氧化应激能力，减轻氧化应激诱导的神经细胞损伤，进而起到神经保护的作用。该结果为帕金森病发生发展的分子机制和治疗方向提供了新的线索和依据。