慢性应激模型大鼠体重、摄食变化与粪便代谢物的相关性研究*

赵 丹， 王少贤, 2△， 梁文杰， 王一旭， 李媛媛， 王坤红, 4

(1河北中医学院基础医学院， 2河北省心脑血管病中医药防治重点实验室， 3河北中医学院中西医结合学院， 河北 石家庄 050200； 4河北医科大学研究生学院， 河北 石家庄 050000)

心理应激不但可引发抑郁、焦虑和恐惧等情绪障碍，体重下降和摄食量减少也成为慢性持续应激刺激机体出现的常见反应。神经、免疫、内分泌、消化、心血管和生殖等系统共同参与调节应激反应，机体通过适当调节各系统代谢，可有效应对应激损伤[1]。代谢组学是一种研究机体在受到环境、行为和病理等不同因素刺激后，对体内小分子代谢产物变化进行系统测量和分析的方法，可以揭示外源性刺激引起内源性代谢产物的变化规律[2-3]。近20年，代谢组学技术已被成熟应用于动物实验研究。相关学者已从慢性温和不可预知应激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)或慢性束缚应激大鼠尿、血和海马组织等样本中，发现了与抑郁有关的小分子代谢产物[4-8]。极少量文献报道采用代谢组学技术研究 CUMS 模型大鼠粪便中代谢产物变化规律，并评价其与抑郁情绪的相关性[9]，但应激大鼠摄食量、体重变化与粪样代谢产物相关性研究尚未见报道。

本研究观察了慢性应激模型大鼠摄食量和体重变化，动物在旷场实验和高架十字迷宫实验中的行为学改变及糖水偏好、血清D-木糖含量和小肠炭末推进率，并采用基于核磁共振氢谱(1H-nuclear magnetic resonance spectroscopy，1H-NMR)的代谢组学技术和多元统计检测分析慢性应激大鼠与正常大鼠粪样差异代谢物，探讨慢性应激导致其体重和摄食量变化的机制。

材 料 和 方 法

1 动物

实验动物购自北京维通利华实验动物技术有限公司，6～7周龄，体重180～200 g，雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠48只，SPF级，动物合格证号为SCXK(京)2016-0006。清洁级动物房饲养，室内温度20～22 ℃，昼夜明暗交替时间12/12 h(7:00～19:00为明期，19:00～7:00为暗期)，相对湿度40%～50%。实验程序通过河北中医学院实验动物伦理委员会批准，尽可能将实验动物的痛苦和数量降低到最小。

2 试剂与仪器

D-木糖购自Biotopped Science&Technology；血清D-木糖检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；核磁共振标准品Anachro Certified DSS Standard Solution(ACDSS)购自CIL；Amicon®ULTRA 3 kDa超滤膜购自Millipore。SpectraMax®Plus 384读板机(酶标仪)购自MD；XP205分析天平购自Mettler-Toledo；Centrifuge 5415R 和5424R高速冷冻离心机购自Eppendorf；Bruker AV III 600 MHz 型核磁共振(NMR)谱仪购自Bruker；Sonics VCX130超声波破碎仪购自Sonics & Materials。

3 方法

3.1动物分组与模型制备 48只大鼠适应喂养1周，随机分为正常组(control组)和慢性束缚应激组(stress组)，每组24只大鼠，每4只大鼠1笼，每组6笼。参考课题组之前发表文献[10-13]方法，慢性束缚应激组每天3 h，连续21 d将大鼠捆绑于特制T型束缚木架，正常组大鼠常规饲养21 d。

3.2大鼠摄食量和体重检测 在束缚应激前，称量大鼠体重和摄食量作为第0天(day 0)数据，应激后每3 d称量1次大鼠体重和摄食量，即day 3、day 6、day 9、day 12、day 15、day 18和day 21各称量1次，共计8次。当日摄食量 = 前一日给食量-当日剩余食量。

3.3行为学实验 旷场箱底面积100 cm×100 cm，被平分为25小方格，最中心9个小方格组成中央区。高架十字迷宫结构：长45 cm×宽15 cm的开放臂2条，长45 cm×宽15 cm×高30 cm的封闭臂2条，一个联结4条臂的中央平台(15 cm×15 cm)，封闭臂顶部开放，开放臂与封闭臂呈十字形。

由SuperMaze 动物行为学视频分析系统，以5 min为计时单位，记录束缚应激前day 0和应激开始后day 7和day 21两组大鼠行为学指标变化。旷场实验行为学指标包括大鼠在旷场箱内总移动距离和中央区移动距离。高架十字迷宫行为学指标包括大鼠进入2条开放臂和2条封闭臂次数和停留时间。

3.4糖水偏好实验 根据文献[14]，先对大鼠进行训练(以笼为单位)：撤掉一直饮用的纯净水(淡水)，先予2瓶1%蔗糖溶液(糖水)自由饮用24 h，然后换成1瓶糖水和1瓶淡水自由饮用24 h，之后禁食禁水24 h，训练结束，即刻正式开始实验。予1瓶糖水和1瓶淡水给大鼠自由饮用1 h，记录糖水和淡水消耗量(mL)，糖水偏好率(%)=糖水消耗量/(糖水+淡水消耗量)×100%。分别在应激前day 0、应激后day 7和day 21记录3次糖水偏好率。

3.5血清D-木糖含量测定 实验结束，大鼠禁食12 h，每组随机选取12只大鼠灌服5% D-木糖溶液2 mL，1 h后予2%戊巴比妥钠(40 mg/kg体重)腹腔注射麻醉，断头取血2 mL， 4℃离心10 min，相对离心力1 041 ×g，分离血清，根据试剂盒说明采用间苯三酚法检测大鼠血清D-木糖含量，其中正常组取3只未服D-木糖大鼠血清备用空白管检测。

3.6小肠炭末推进率检测 取材前25～30 min，每组10只大鼠灌胃10% 炭粉混悬液 2 mL，麻醉断头处死大鼠后，快速取出胃和小肠，将小肠自然平铺，测量自幽门括约肌至回肠末端全段小肠长度和炭末在小肠内的推进距离，计算小肠炭末推进率(%)=炭末推进距离/小肠全长×100%。

3.7基于1H-NMR技术的粪样代谢组学检测 实验结束，每组采集10只大鼠粪便，各称量50 mg冻干粪样，加入1 000 μL纯水，涡旋1 min，冰水浴超声萃取32 s，相对离心力14 360 ×g，4℃离心15 min，然后超滤膜离心过滤45 min；取滤液450μL，加入核磁共振标准品 ACDSS 50μL涡旋10 s，相对离心力14 360×g，离心2 min，取480μL上清于核磁共振管中，Bruker AV III 600 MHz 谱仪2D-1H NOESY脉冲序列采集1H-NMR数据。

参考文献[15]方法，将1H-NMR信号导入软件Chenomx NMR 套装8.1版本(Chenomx)，通过校正基线，调整谱图峰形，比对分析，最终获得20份大鼠粪样的小分子代谢物和浓度值。并采用偏最小二乘法判别分析(partial least square-discriminant analysis，PLS-DA)模型进行多元统计分析，获得差异代谢物数据和图示。采用交叉验证(cross-validation，CV)对PLS-DA判别分析模型质量进行检验，模型的分类效果采用置换检验来评价，结果均表明所采用模型质量稳定可靠，分类效果较好。

4 统计学方法

以SPSS 22.0的一般线性模型(general linear model，GLM)的球形检验(Mauchly’s test of sphericity)首先对2组大鼠体重、摄食量、行为学和糖水偏好率不同时间重复测量数据进行相关性分析，如果时间、时间与分组交互、分组因素效应显著，有统计学意义(P<0.05)，则每个时点的组间差异采用单因素方差分析，组内不同时点比较采用重复测量数据多重比较配对的t检验法(Bonferroni法；由于每组内各个时点上的两两比较结果输出内容较多，可结合均数图直观观察到2组大鼠体重、摄食量、行为学指标随时间的变化趋势，所以省略每组之内在各个时点上的两两比较)；2组大鼠血清D-木糖含量、小肠炭末推进率比较采用成组t-test分析；指标之间相关性采用Pearson相关分析。资料以均数±标准误(mean±SEM)表示，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 体重和摄食量变化

在束缚应激前，2组大鼠皮毛光泽，活动自如，体重和摄食量差异均无统计学显著性(P>0.05)；应激因素施加1～4 d，大鼠反抗剧烈，频繁挣脱束缚；至束缚应激第2周，大鼠反抗和挣脱能力逐渐下降，体重较正常组大鼠增长缓慢，摄食量显著下降(P<0.01)；在束缚应激最后1周，大鼠基本无反抗和挣脱，体重和摄食量较正常大鼠呈持续下降趋势(P<0.01),见表1。

2 行为学变化

2.1旷场实验(open-field test，OFT) 实验前，2组大鼠5 min在旷场内总移动距离和中央区移动距离差异无统计学显著性(P>0.05)。在实验第7天和第21天，应激大鼠5 min总移动距离和在中央区移动距离均较正常组大鼠显著减少(P<0.01),见表2。

2.2高架十字迷宫实验(elevated plus-maze test，EPM test) 束缚应激前，高架十字迷宫实验5 min内2组大鼠在开放臂和封闭臂停留时间和进入次数差异均无统计学显著性(P>0.05)。在束缚应激第7天和21天，5 min内应激大鼠在开放臂停留时间较正常大鼠显著缩短(P<0.01)，虽然进入开放臂次数有所减少，但组间比较差异无统计学显著性(P>0.05)；应激第21天大鼠进入封闭臂次数显著减少(P<0.01)但停留时间延长，2组封闭臂停留时间比较差异亦无统计学显著性(P>0.05)，见表3。

表1 2组大鼠体重和摄食量比较

**P<0.01vscontrol group.

表2 2组大鼠在旷场内总移动距离和中央区移动距离比较

**P<0.01vscontrol group.

表3 高架十字迷宫实验2组大鼠行为学指标比较

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

3 糖水偏好实验

应激前，2组大鼠对糖水的偏好差异无统计学显著性(P>0.05)，而束缚应激能够降低大鼠对糖水的偏好，应激21 d时，2组差异显著(P<0.05)，见表4。

表4 2组大鼠糖水偏好率比较

*P<0.05vscontrol group.

4 血清D-木糖含量和小肠炭末推进率测定

应激21 d大鼠血清D-木糖含量较正常组大鼠显著下降(P<0.01)，小肠炭末推进率低于正常大鼠，但组间比较差异无统计学显著性(P>0.05),见图1。

5 大鼠粪样1H-NMR代谢组学结果

经过对大鼠粪样谱图信号与Chenomx自带数据库进行比对分析，最终获得 58 种代谢物，主要包括氨基酸及其分解产物、胺及其化合物、有机酸类、糖类、醇类和核酸成分共6类。初步分析慢性束缚应激组1个样本与同组差异较大的被剔除，最终10个正常组粪便样本和9个慢性束缚应激组样本数据被纳入统计。首先采用 Pareto Scaling 法对2组代谢物数据进行归一化，然后采用PLS-DA进行多元统计分析，最终获得得分图(Scores plot)、载荷图(Loading plot)、VIP(Variable Importance in Projection)图、VIP值>1差异代谢物t-test 图，见图2。

Figure 1.The serum D-xylose content and small bowel transit rate in two groups. A: the serum D-xylose content in two groups.n=12. B: the small bowel transit rate in two groups.n=10. Mean±SEM.**P<0.01vscontrol group.

图1 2组大鼠血清D-木糖含量和小肠炭末推进率比较图

PLS-DA 的VIP图，默认 VIP值>1 的变量(代谢物)差异具统计学显著性。本研究VIP值>1的代谢物包括乙酸盐(acetate)、丁酸盐(butyrate)、葡萄糖(glucose)、丙酸盐(propionate)、谷氨酸盐(glutamate)、核糖(ribose)、庚二酸盐(pimelate)、乳酸盐(lactate)、丙氨酸(alanine)和戊酸盐(valerate)共10种，2组间比较，慢性束缚应激组高于正常组，进行t-test分析差异均有统计学显著性(P<0.05)，见图2D、表5。

表5 2组大鼠粪样VIP值>1的差异代谢物含量比较

Table 5.Differential metabolites level(VIP value >1) in the two groups (mg/g. Mean±SEM)

MetabolitesControl (n=10)Stress (n=9)Acetate3.1992±0.36305.3237±0.2253∗∗Butyrate0.7705±0.09492.4143±0.2565∗∗Glucose0.8098±0.08352.3648±0.4151∗∗Propionate1.2010±0.10291.8864±0.0554∗∗Glutamate0.5547±0.12911.3528±0.2400∗Ribose0.5483±0.06650.9942±0.1143∗∗Pimelate0.1089±0.01440.3816±0.0730∗∗Lactate0.0855±0.00900.3322±0.0531∗∗Alanine0.1755±0.03080.4456±0.0775∗∗Valerate0.1946±0.02400.3993±0.0462∗∗

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

6 慢性应激大鼠体重、摄食量、血清D-木糖含量、糖水偏好率、小肠炭末推进率和差异代谢物相关性分析

Pearson相关分析表明，应激大鼠体重与摄食量、血清D-木糖含量、小肠炭末推进率、糖水偏好率和差异代谢物相关性均不显著(P>0.05)；摄食量与粪样差异代谢物中acetate和pimelate呈显著负相关(P<0.05)；小肠炭末推进率与pimelate和lactate呈显著负相关(P<0.05)，见表6。

讨 论

心理应激研究目前多着重于应激引发的抑郁、焦虑等情绪障碍[16-17]，但对于其导致的体重增长缓慢、食欲下降等机制研究尚不足。束缚制动是目前制备心理应激动物模型的经典方法之一[18-19]。糖水偏好实验可有效评价动物抑郁情绪的特征表现[20]。实验大鼠在旷场箱和高架十字迷宫中的自主行为、探究行为，以及探究与回避的矛盾冲突行为，是评价动物紧张、焦虑、抑郁行为的经典方法[21-22]。本研究结果表明，与正常大鼠比较，应激大鼠5 min内在旷场箱活动距离减少，进入高架十字迷宫开放臂次数和停留时间均减少，而在封闭臂停留时间增加，应激第21天大鼠对糖水的偏好程度也显著下降，说明慢性束缚应激导致实验大鼠探究性行为减少，自主行为活动能力下降，逐渐出现紧张、抑郁、焦虑等不良情绪。与课题组前期报道[23-24]和国内外相关文献研究结果一致[25-27]。

在实验过程中，伴随应激时间增加，我们观察到应激大鼠出现体重增长缓慢，摄食量减少，血清D-木糖含量下降，小肠炭末推进率降低，说明束缚应激不但引发实验动物出现了情绪障碍，胃肠动力和吸收功能也出现下降。但分析血清D-木糖含量和小肠炭末推进率与大鼠体重、摄食量之间并无显著相关性，说明束缚应激大鼠胃肠动力和吸收能力改变，并非是导致其体重、摄食量变化的直接因素，机体的代谢水平可能在其中发挥一定作用[13]。

采用1H-NMR代谢组学技术检测慢性束缚应激大鼠血清中不饱和脂肪酸、血糖、高密度脂蛋白等化合物含量较正常大鼠明显降低[8]。本研究采用同样应激方法，大鼠粪便中葡萄糖、核糖含量水平明显高于正常大鼠。提示应激大鼠肠道对糖类吸收功能明显下降，体内存在严重的糖类和能量代谢紊乱。短链脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)作为营养物质被吸收，可为肠上皮细胞提供主要能量来源，维持肠道上皮细胞的完整性和正常功能，对抗炎症，调节免疫反应和肠道菌群平衡等[28-30]。本研究应激大鼠粪便中以乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐为主要成分的SCFAs盐类排出量明显增多，说明长期慢性应激不但影响了肠道的能量代谢，还影响了肠上皮细胞的结构和功能，出现肠道免疫功能的下降等。乳酸为关键的能量载体[31-32]，应激大鼠粪便排出乳酸盐增多，说明机体存在能量代谢紊乱，与相关研究结果一致[9]。谷氨酸、丙氨酸与蛋白质氨基酸代谢有关。有研究表明，谷氨酸缺乏是引起肠黏膜萎缩的主要原因，丙氨酸在内脏氮循环中起着重要作用，可通过影响谷氨酰胺、一氧化氮的生成，使小肠绒毛萎缩，肠壁变薄，小肠完整性和免疫功能降低[33]；同时丙氨酸可通过丙氨酸-葡萄糖循环参与葡萄糖代谢，具有显著的免疫和生糖作用。本研究中，应激大鼠粪样中丙氨酸、谷氨酸盐排出增多，推测体内丙氨酸、谷氨酸吸收不足，蛋白质氨基酸代谢紊乱，能量代谢异常，肠道的完整性和免疫功能受到影响。

Figure 2.PLS-DA analysis of metabolites between two groups. The scores plot (A), the loading plot (B), the VIP plot (C) of PLS-DA analysis between two groups, and the statistical analysis plot(D) for metabolites (VIP value >1) obtained from PLS-DA witht-test.n=10 in the control group, andn=9 in the stress group. In figure 2D, the dotted line represents the threshold line ofP=0.05, the metabolites ofP>0.05 are marked with gray points, the metabolites ofP<0.05 are marked with red points, and the metabolites of the VIP value >1 obtained by PLD-DA analysis are marked with blue points.

图2 2组大鼠粪样代谢物PLS-DA分析图

表6 慢性束缚应激大鼠体重和摄食量与其它指标相关性

*P<0.05,**P<0.01.

研究结果提示，应激大鼠体内不仅存在胃肠动力和吸收功能下降，更存在能量代谢异常、蛋白质氨基酸代谢紊乱。而应激大鼠摄食量与粪样代谢物acetate和pimelate呈显著负相关，说明acetate和pimelate变化及其相关代谢途径的改变，可能是慢性束缚应激引起大鼠摄食量变化机制之一，相关研究在文献中未见报道。但体重变化与粪样代谢物相关性不明确，其机制有待进一步研究。

粪便是机体代谢的最终产物，也是研究应激反应的重要内容。粪便作为代谢组学研究样本在目前应激文献中很少涉及。但粪便也是宿主与肠道微生物相互作用相互影响所形成的共同代谢产物，acetate在本研究所获得差异代谢物中浓度水平最高，应激状态下肠道菌群种属和数量的改变如何影响到粪便代谢物acetate和pimelate变化为课题组下一步需要明确的研究内容。