两种饲养方式下苏尼特羊肉中鲜味物质含量及相关调控基因表达量

罗玉龙，刘 畅，李文博，王柏辉，窦 露，赵丽华，杜 瑞，王政纲，靳 烨*

（内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古 呼和浩特 010018 ）

苏尼特羊是我国优良的绵羊品种，其产肉性能好、膻味轻、肉质鲜美，有很高的营养价值[1]；其饲养方式以传统放牧为主，随着国家限牧政策的施行，部分饲养模式已转变为舍饲。舍饲饲养羊的生产潜力虽有提高，但其风味品质已呈现出下降趋势。鲜味是衡量羊肉风味的一项重要指标，核苷酸与呈鲜味氨基酸等决定了肉质鲜味，这些成分通过与舌上皮细胞的G蛋白偶联受体作用产生味感[2]。研究发现，肌苷酸（inosine monophosphate，IMP）是鲜味最强的物质，能够提高肉的鲜味[3-4]。目前的研究集中于鸡、鱼等动物，对羊肉中鲜味物质的研究还比较少。翁丽萍等研究养殖与野生大黄鱼的鲜味物质，发现野生大黄鱼滋味鲜美的原因与其肉中高含量的IMP有关[5]。张会丰等研究发现笼养鸡肌肉中IMP含量显著低于散养鸡[6]。闫俊书等发现放养鸡的肉更鲜，这与放养使鸡的运动强度提高、代谢活动增强，从而提高了肉中IMP含量有关[7]。而鲜味物质的形成同时受多种酶的调控，其中腺苷-磷酸脱氨酶（adenosine monophosphate deaminase 1，AMPD1）、腺苷酸琥珀酸裂解酶（adenylosuccinate lyase，ADSL）、次黄嘌呤核苷酸环水解酶（aminoimidazole carboxamide ribonucleotide transformylase，ATIC）起关键作用，而这3 种酶的基因也是肉鲜味研究的候选基因[8]。

因此，本实验通过对放牧和舍饲条件下的苏尼特羊肉进行电子舌测定，从味觉指标上评价两者差异，进而分析苏尼特羊肉的鲜味物质含量以及相关调控基因表达量，并分析鲜味物质与调控基因之间的联系，为苏尼特羊肉鲜味物质的形成机理提供理论依据，为改进饲养管理模式、改善羊肉风味品质提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

从内蒙古乌拉特中旗畜牧业苏尼特羊育种园区内随机选择放牧与舍饲两种饲养条件下健康无病的12 月龄苏尼特羊各10 只（公、母各5 只）。舍饲饲养以饲草料（玉米秸秆、葵盘粉等，并补充玉米精料及育肥饲料）为主，放牧饲养则以乌拉特中旗天然草原牧场中的牧草（芨芨草、蒙古葱、沙生冰草、碱韭等）为主。

三乙胺、氯仿、无水乙醇、磷酸、高氯酸（均为分析纯） 北京国药集团试剂公司；甲醇、次黄嘌呤（hypoxanthine，HYP）标准品、肌苷（inosine，INO）标准品、IMP标准品、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）标准品、一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）标准品（均为色谱纯） 美国Sigma公司；焦碳酸二乙酯 美国Thermo Fisher公司；RNAiso Plus、6×loading buffer、Marker DL2000、Premix Taq®Version 2.0、PremeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR®Premix Ex TaqTM大连宝生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

1260型高效液相色谱仪 美国安捷伦公司；5810-R型低温台式冷冻离心机 德国Eppendorf公司；BG-power5000型稳压稳流电泳仪 北京百晶生物科技有限公司；水平电泳槽、凝胶成像分析仪、CFX96TM实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）仪 美国Bio-Rad公司；普通PCR仪 美国Applied Biosystems公司；TS-5000Z型电子舌 北京盈盛恒泰科技公司。

1.3 方法

1.3.1 羊肉的处理

对所选取20 只苏尼特羊现场屠宰，宰前禁食24 h，禁水2 h，在宰后的1 h内从羊的背最长肌、臂三头肌以及股二头肌各取约2 g肌肉放入无菌无酶管中，于-80 ℃保藏待用，用于鲜味物质及调控基因的测定；另各取约50 g肌肉于-20 ℃保藏，进行电子舌测定。

1.3.2 滋味检测

称取切成肉糜状的羊肉10 g，加入100 mL 0.1 mol/L KOH溶液，磁力搅拌30 min后3 000 r/min、4 ℃离心10 min，取上清液80 mL用于电子舌测试。

电子舌分析条件[9]：传感器在RefSol参比溶液（30 mmol/L KCl溶液与0.3 mmol/L酒石酸溶液混合液）中归零30 s，达到平衡后于样品溶液中进行鲜味测定。测试时间为30 s，用参比溶液清洗330 s，再于参比溶液中进行回味测定30 s，每个样品重复测定3 次。

1.3.3 鲜味物质含量测定

取1 g肉样置于10 mL离心管中，加入4 mL体积分数5%高氯酸后匀浆；匀浆液3 500 r/min、4 ℃离心5 min后取上清液过滤，调至pH 6.5，滤液转移至25 mL棕色容量瓶定容，取1 mL溶液用0.45 μm水系滤膜过滤，用于高效液相色谱分析。

色谱条件：C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相，体积分数5%甲醇+体积分数95%磷酸-三乙胺溶液；流速0.7 mL/min；柱温25 ℃；紫外检测波长254 nm；进样量20 μL；运行时间34 min。

混合标准品标准曲线：取混合标准品系列工作液重复测定3 次后取平均峰面积。以相应鲜味物质峰面积对其质量浓度进行线性回归，得到各标准品的回归方程。通过标准曲线计算鲜味物质含量。

1.3.4 基因表达量的测定

1.3.4.1 qPCR引物设计合成

引物序列如表1所示，AMPD1、ATIC、ADSL、18S rRNA引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成，以18S rRNA作为内参基因。

表1 qPCR引物Table 1 Primer sequences used for qPCR

1.3.4.2 总RNA的提取与反转录

称取约100 mg肉样放入经液氮冷却的研钵中，研磨至细粉末状用于RNA提取。参照文献[10]的方法提取RNA并测定吸光度（A260nm/A280nm）及质量浓度。用质量分数1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。将RNA样品稀释至500 ng/μL后反转录为cDNA，反转录方法参照试剂盒说明书的两步法进行，将得到的cDNA放入-20 ℃冰箱内保存。

1.3.4.3 qPCR分析

以cDNA为模板，参照试剂盒说明书的两步法进行qPCR分析[11]。PCR体系为：12.5 μL SYBR®Premix ExTaqTMII (TLi RNaseH Plus)、1.0 μL引物F、1.0 μL引物R、2.0 μL cDNA模板、8.5 μL RNase Free dH2O。程序为：预变性95 ℃、30 s；变性95 ℃、5 s，退火60 ℃、30 s，延伸72 ℃、30 s，35 个循环；延伸72 ℃、10 min。

样本重复测定3 次，得到不同样本的Ct值，以18S rRNA为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1.4 数据统计与分析

用SPSS 20.0软件进行统计学分析，用单因素分析法分析数据差异性，P＜0.05时差异显著；P＜0.01时差异极显著，用双变量相关分析法（Pearson）分析数据相关性。

2 结果与分析

2.1 两种饲养方式下苏尼特羊肉的电子舌检测结果

屠宰后，由于外界环境和自身反应，羊肉会产生特有的滋味，如蛋白质水解成小分子肽、氨基酸等，其中带有疏水性氨基酸的肽能产生苦味，而一些核苷酸、谷氨类氨基酸可产生鲜味[12-13]。以电子舌测定味觉指标的无味点为0，无味点以下认为样品没有此种味道[14]。本研究中，鲜味、咸味、苦味、涩味和苦味回味均在无味点以上，可以作为有效的评价指标。其中鲜味和咸味对羊肉滋味的影响最大，苦味次之。

表2 两种饲养方式下苏尼特羊肉的味觉特征差异分析Table 2 Comparative taste characteristics of meat from Sunit sheep under different feeding patterns

由表2可知，整体上放牧饲养苏尼特羊肉的鲜味显著高于舍饲饲养（P＜0.05），这反映了放牧饲养苏尼特羊肉质更为鲜美。在放牧和舍饲两种饲养条件下，羊臂三头肌的鲜味均显著低于背最长肌和股二头肌（P＜0.05），说明肌肉部位也会造成羊肉中的鲜味差异，而背最长肌和股二头肌的肉质较为鲜美。咸味主要来自肉中的谷氨酸单钠盐、天冬氨酸钠以及氯化钠等无机盐[15]。在放牧和舍饲两种饲养条件下，羊背最长肌的咸味均显著高于股二头肌和臂三头肌（P＜0.05）；对于同一部位，放牧饲养羊背最长肌的咸味显著高于舍饲饲养（P＜0.05），而其股二头肌和臂三头肌的咸味与舍饲饲养差异不显著（P＞0.05）。产生涩味的化学物质主要有明矾类与多酚类等；而苦味则以单宁、苯硫脲为主[16]。在放牧饲养条件下，羊背最长肌的苦味显著低于臂三头肌和股二头肌（P＜0.05），但涩味显著高于股二头肌（P＜0.05）。在舍饲饲养条件下，羊背最长肌的苦味和涩味均显著低于臂三头肌和股二头肌（P＜0.05）。整体上，放牧饲养苏尼特羊肉的苦味和涩味低于舍饲饲养，这是由于放牧饲养羊长期摄入一些草本植物（沙葱、碱韭、沙茴香等），可有效抑制羊肉中的不良滋味；而舍饲饲养羊长期食用饲料，其肉中积累了大量的单宁，使的肉的苦涩味增加[17]。放牧饲养苏尼特羊肉鲜味和咸味高于舍饲饲养，苦味和涩味低于舍饲饲养，从味觉指标上评价，放牧饲养羊肉更为鲜美。

2.2 两种饲养方式下苏尼特羊肉的鲜味物质含量

苏尼特羊肉风味优良，“鲜”是其突出的风味特征，肌肉中鲜味的主要来源是一些呈鲜肽类和核苷酸[18]。苏尼特羊肉中IMP含量较高，且降解缓慢，在很大程度上能够提高肉的鲜味，被作为评定肉质中鲜味的重要指标[3]。同时，与IMP代谢相关的产物也共同影响着肉的鲜味，包括INO和HYP等[19]。

表3 两种饲养方式下苏尼特羊肉的鲜味物质含量Table 3 Comparative contents of umami substances of meat from Sunit sheep under different feeding patterns

由表3可知，放牧饲养条件下，羊背最长肌和臂三头肌的IMP含量显著高于舍饲饲养（P＜0.05）；舍饲饲养条件下，各部位之间IMP含量没有显著差异（P＞0.05）。整体上，放牧饲养羊肌肉IMP含量高于舍饲饲养，这与张会丰等的研究结果[6]一致。产生差异的原因可能是运动量不同导致了IMP含量的不同，放牧饲养羊运动强度大，其肌肉中的代谢活动会增强，使得ATP含量增加，合成IMP的能力提高，这使得放牧饲养羊的肉质较为鲜美[20]；另一方面，放牧饲养羊摄食大量牧草，肉中的抗氧化物质丰富，屠宰后组织细胞膜的完整性得到保护，鲜味物质流失减少，这也提高了IMP含量[21]。

IMP可在磷酸脂酶和核苷水解酶的作用下进一步分解形成INO和HYP[22]。整体上，放牧饲养苏尼特羊肉的INO含量显著高于舍饲饲养（P＜0.05）。放牧饲养羊背最长肌的INO含量显著高于臂三头肌和股二头肌（P＜0.05）；舍饲饲养羊臂三头肌的INO含量显著低于背最长肌和股二头肌（P＜0.05）。放牧方式对HPY含量没有显著影响，但其均在背最长肌中含量最高（P＜0.05）。ADP和AMP是形成IMP的前体物质，AMP可在脱氨酶作用下脱氨形成IMP，这两者在肉中的含量相对较少，在背最长肌中的含量较其他部位更高。对于同一部位，放牧饲养羊臂三头肌和股二头肌中AMP含量显著高于舍饲饲养（P＜0.05），但其背最长肌中AMP含量显著低于舍饲饲养（P＜0.05）。造成羊肉中鲜味物质含量差异的原因不仅与运动强度以及摄食饲料不同有关，也与屠宰后肉中IMP等物质的降解程度有关，这些因素造成了放牧饲养羊肉中IMP和相关代谢物比较丰富，从而使肉的鲜味变得浓郁[23-24]。

2.3 两种饲养方式下调控鲜味物质候选基因表达量

调节控制IMP形成的酶由AMPD1、ADSL、ATIC组成。AMPD1能催化AMP水解、脱氨，生成IMP；ADSL具有催化嘌呤核苷酸的起始合成与循环的双功能作用，是影响IMP生成的关键限速酶；ATIC是一种具有氨基咪唑氨甲酰核苷酸转甲酰基酶和ATIC催化活力的双功能酶，能调控IMP的合成[25-26]。

表4 两种饲养方式下苏尼特羊肉中调控鲜味物质候选基因表达量的差异Table 4 Comparative expression levels of umami-related genes in meatfrom Sunit sheep under different feeding patterns

由表4可知，放牧饲养羊背最长肌的AMPD1基因表达量显著高于臂三头肌和股二头肌（P＜0.05）；同时，背最长肌和股二头肌的ADSL基因表达量显著高于臂三头肌（P＜0.05）；ATIC基因表达量在股二头肌中最高（P＜0.05）。舍饲饲养羊背最长肌和股二头肌的ADSL基因表达量显著高于臂三头肌（P＜0.05），与放牧饲养羊呈现一致性。对于同一部位，放牧饲养羊背最长肌的AMPD1基因表达量显著高于舍饲饲养（P＜0.05）；股二头肌的ADSL和ATIC基因表达量显著高于舍饲饲养（P＜0.05）。整体上，放牧饲养羊肌肉中AMPD1、ADSL、ATIC基因表达量较舍饲饲养羊高，进一步调控形成鲜味物质的酶来提高羊肉中的鲜味物质含量，从而使放牧饲养羊肌肉中鲜味物质含量高于舍饲饲养。

2.4 调控鲜味物质基因表达量之间的相关性分析

由表5可知，3 种调控苏尼特羊肉鲜味物质形成的基因表达量之间均呈正相关，这表明3 种酶在调控IMP形成时有协同促进的作用。其中，放牧饲养苏尼特羊肉AMPD1表达量与ADSL表达量之间呈极显著正相关（P＜0.01），说明AMPD1基因高表达正向调控ADSL基因的表达，使羊肉中的IMP沉积，改善羊肉的鲜味。研究发现，ADSL基因在嘌呤核苷酸的从头合成中发挥重要功能，能够维持肌肉组织中ATP含量与AMP含量的比例，为生成IMP提供前体物质[27]；而AMPD1基因调控AMPD1直接催化AMP脱氨生成IMP，这两种酶协同作用促进了IMP的生成，极大地影响了肉质风味[28]。

表5 苏尼特羊肉中调控鲜味物质候选基因表达量的相关性Table 5 Correlations among the expression levels of umami-related genes in meat from Sunit sheep

2.5 IMP含量和调控基因表达量的相关性比较

表6 苏尼特羊肉中调控IMP基因表达量与IMP含量相关性分析Table 6 Correlation analysis between IMP content and the expression of related genes in meat from Sunit sheep

羊肉中IMP含量远高于其他鲜味成分，其是影响鲜味的主要成分，因此对IMP含量与其调控基因表达量进行相关性分析。由表6可知，放牧饲养苏尼特羊肉中IMP含量与AMPD1表达量基因之间呈极显著正相关（P＜0.01），IMP含量与ATIC基因表达量之间呈显著正相关（P＜0.05），肉中AMPD1、ATIC基因多态位点的基因型频率分布与IMP含量具有相关性，是控制羊肉鲜味物质的候选基因，能参与调控肉中IMP等物质的含量[1]。舍饲饲养苏尼特羊肉中IMP含量与ATIC基因表达量之间呈显著正相关（P＜0.05），与放牧饲养的结果一致，这与罗桂芬等的研究结果[29]一致。这进一步印证了ATIC基因是影响肌肉中IMP含量的主效基因，可调控相关酶的活性，进而改变肉中的IMP含量[30]。整体上，本研究结果表明当IMP调控基因的表达量提高时，肉中的IMP含量也提高。这也印证了IMP与调控基因编码之间存在着某种作用机制，使得IMP含量和基因表达量的变化趋势一致。

3 结 论

对苏尼特羊肉进行味觉评价，发现放牧饲养苏尼特羊肉鲜味和咸味高于舍饲饲养，苦味和涩味低于舍饲饲养。其中放牧饲养苏尼特羊肉中的IMP和INO含量高于舍饲饲养；放牧方式对HPY含量没有显著影响，但其含量均在背最长肌中最高（P＜0.05）。整体上，放牧饲养羊肉的鲜味物质含量高，其肉质更为鲜美。

放牧饲养羊肌肉中AMPD1、ADSL、ATIC基因表达量较舍饲饲养高，其中，放牧饲养羊背最长肌的AMPD1基因表达量显著高于舍饲饲养（P＜0.05），股二头肌的ADSL和ATIC基因表达量显著高于舍饲饲养（P＜0.05）。这说明通过调控形成鲜味物质的酶可改变羊肉中鲜味物质含量。

鲜味物质调控基因的相关性分析中，3 种基因表达量相互间均呈正相关，其中放牧饲养羊肌肉中AMPD1表达量与ADSL表达量之间呈极显著性正相关（P＜0.01）。IMP含量与其调控基因的相关性分析中，放牧饲养羊肌肉中IMP含量与AMPD1基因表达量之间呈极显著正相关（P＜0.01），IMP含量与ATIC基因表达量之间呈显著正相关（P＜0.05）；舍饲饲养羊肌肉中IMP含量与ATIC基因表达量之间呈显著正相关（P＜0.05）。这表明当IMP调控基因的表达量提高时，相关酶的活性提高，肉中的IMP含量也随之提高。