香芹酚对阴沟肠杆菌的抑菌作用及机理

周 祺，袁 康，刘 芳，都立辉,*

（1.南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室，江苏 南京 210023 ；2.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京 210014 ）

阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）是一种重要的条件致病菌，人体的多个器官、系统包括皮肤软组织、泌尿道、呼吸系统等都可能由其引发细菌感染性疾病；其可通过气管以及有创伤的皮肤表面等多个途径传播。阴沟肠杆菌对营养的要求较低，其广泛存在于动物肠道中，由其引起的食物中毒事件也时有发生[1-3]。近年来，随着抗生素等抗菌药物的频繁使用，阴沟肠杆菌的耐药性问题也得到了越来越多的关注[4-5]。鉴于食品中丰富的营养环境，阴沟肠杆菌可在多种食品中繁殖。这不仅导致了食品的腐败变质，还造成了相应食品的安全隐患，经传统热杀菌和普通化学杀菌制备的食品中常能检出这类细菌的存在。因此，控制阴沟肠杆菌的生长、减少由其引起的食物中毒事件是食品相关工作者的目标。

香芹酚又名2-甲基-5-异丙基苯酚，分子式为C10H14O，是牛至和百里香等植物精油的主要成分[6]。香芹酚易溶于乙醇，几乎不溶于水。在日常生活中，香芹酚可用于制作香料、食品添加剂、驱虫剂、卫生杀菌剂、防腐剂等。近年来，香芹酚的抑菌性也受到了广泛的关注[7-9]。研究发现，香芹酚对微生物、螨虫等均具有抑制作用[10-11]。前期有研究发现，香芹酚对细菌、霉菌等的细胞形态均存在破坏作用，同时能够影响细胞的完整性与功能性[12]。所以，推测香芹酚在破坏细胞膜的完整性方面起着重要的作用。本实验旨在研究香芹酚对阴沟肠杆菌细胞的杀菌效果和作用机制，通过检测香芹酚处理后阴沟肠杆菌细胞胞外ATP化学发光值，利用激光共聚焦显微镜观察香芹酚处理对细菌细胞膜通透性的影响，并采用扫描电子显微镜观察香芹酚对细菌细胞形态的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

香芹酚（纯度99%） 湖北鑫润德化工有限公司；阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae C4） 江苏省农业科学院；BHI培养基 北京陆桥生物技术有限责任公司；PI 生工生物工程股份有限公司；DiSC3(5)、5(6)-cFDA美国Sigma公司；ATP检测试剂盒 上海碧云天生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

酶标仪 美国伯腾仪器有限公司；THZ-C台式恒温振荡器 苏州培英实验设备有限公司；转盘式激光共聚焦显微镜 美国铂金埃尔默公司；扫描电子显微镜德国蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培养

阴沟肠杆菌接种于BHI液体培养基中，生长至对数期时将菌液与灭菌后质量分数40%甘油以体积比1∶1混合后保存在-80 ℃冰箱中备用。活化时将冻存的菌液解冻后以体积分数1%接种于BHI培养基中，30 ℃培养12 h。

1.3.2 香芹酚对阴沟肠杆菌的最小抑菌浓度的测定

将生长至对数期（OD600nm＝0.6）的阴沟肠杆菌以体积分数1%接种于一定体积的BHI液体培养基中备用，将香芹酚溶于体积分数60%乙醇中得到初含量为16 μL/mL的香芹酚溶液。把配制好的菌液按体积比1∶1加入二倍稀释后的香芹酚溶液中，得到香芹酚终含量分别为2、1、0.5、0.25、0.125 μL/mL的体系，以配制好的菌液加水作为空白对照组，置于30 ℃下培养10 h，检测各处理组在不同时间的OD600nm[13]，以OD600nm无明显变化的最低香芹酚含量为最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

1.3.3 香芹酚抑菌活性的检测

将阴沟肠杆菌菌液按体积分数1%接种于BHI液体培养基中，培养至对数期备用。取10 mL菌液，离心收集菌泥，加入相同体积的含量分别为0（空白对照组）、0.25、0.5、1、2 μL/mL的香芹酚溶液，将菌悬液放入摇床中，分别在0、30、60、90、120、180 min时取样，用灭菌生理盐水按照10 倍体积梯度稀释[14]。每个样品取100 µL均匀地涂布于BHI固体培养基上，置于30 ℃培养48 h后对菌落计数。

1.3.4 扫描电子显微镜观察香芹酚处理对阴沟肠杆菌细胞形态的影响

将生长至对数期的阴沟肠杆菌以体积分数1%接种于培养基中，加入香芹酚至终含量为0.125 μL/mL，将混合液置于30 ℃培养箱中培养8 h，观察香芹酚在培养过程中对菌体形态的影响。取生长到对数期的菌液8 mL于灭菌离心管中，6 000 r/min离心8～10 min得到菌泥，分别加入含量为1 μL/mL和2 μL/mL的香芹酚，以加入相同体积灭菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）作为空白对照组，置于30 ℃处理1 h。以5 500 r/min离心10 min，在4 ℃下使用质量分数2.5%戊二醛固定过夜，2 500 r/min、4 ℃离心5 min。加入超纯水放置10 min，离心，重复3次；用体积分数递增（分别为50%、70%、80%、90%、100%）的乙醇各脱水1 次，将样品固定在镜片上，喷金、拍照[15-16]。

1.3.5 胞外ATP化学发光值测定

将生长至对数期的阴沟肠杆菌菌液以6 000 r/min离心8～10 min，使用pH 7.4 PBS洗涤两次，分别将菌泥悬浮在0（对照组）、0.25、0.5、1、2 μL/mL香芹酚溶液中，30 ℃下培养，分别在0、10、30、60、120、180 min时取样。样品在4 ℃、12 000 r/min离心1 min，取上清液，加入ATP检测试剂，混合均匀后按试剂盒说明书测其化学发光值[17]。

1.3.6 细胞膜内外电势的测定

将5 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸与5 mmol/L葡萄糖混合配制缓冲液A，将培养至对数期的阴沟肠杆菌4 ℃、6 000 r/min离心10 min，将菌泥用缓冲液A重悬2 次并离心。将菌泥重悬于含2 mmol/L乙二胺四乙酸的缓冲液A体系中。向样品中加入荧光探针DiSC3(5)至终浓度为0.5 μmol/L，室温下放置10～15 min。每个样品取200 μL，加入1 μmol/L尼日利亚菌素作为阴性对照，加入10 μmol/L缬氨霉素作为阳性对照，并设置菌悬液为空白对照组，以加入香芹酚溶液至终含量分别为0.25、0.5、1、2 μL/mL作为处理组。使用酶标仪检测其荧光强度，激发波长为622 nm，发射波长为670 nm[18-19]。

1.3.7 细胞膜渗透性观察

使用荧光探针5(6)-cFDA和PI检测细胞膜的受损情况[23]。将培养至对数期的阴沟肠杆菌菌液以6 000 r/min离心10 min，向菌泥中加入等体积的PBS作为空白对照组，以加入含量分别为0.25、0.5、1、2 μL/mL香芹酚溶液作为处理组，在30 ℃、200 r/min恒温振荡器中培养1 h。样品再次离心后用500 μL PBS悬浮菌泥。向每个样品中加入荧光探针5(6)-cFDA至终浓度达到2.5 μmol/L，避光反应10 min；然后加入10 μL红色核酸荧光染液PI使其终浓度为0.5 μmol/L，避光反应10 min。取2～3 μL菌液转接到载玻片上，加上盖玻片，置于激光共聚焦显微镜下观察[20-21]。

1.4 数据统计与分析

每个实验至少重复3 次，采用Excel 2007软件处理数据并绘制图表，使用SPSS 22软件进行多因素方差分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 香芹酚对阴沟肠杆菌的MIC

从图1可以看出，不同含量的香芹酚溶液对阴沟肠杆菌均有一定的抑制效果，当香芹酚含量在0.5 μL/mL以上时抑菌效果明显。因此，推测香芹酚对阴沟肠杆菌的MIC为0.5 μL/mL。随着香芹酚含量的增加，OD600nm下降，说明香芹酚对阴沟肠杆菌的抑制作用随含量的增加而增强。

阴沟肠杆菌是革兰氏阴性菌，可以引发人体食物中毒以及皮肤、呼吸道、胃肠道和其他器官的感染，因此其治疗和耐药性受到越来越多的关注。相比于其他抑菌剂[22-23]，较低含量的香芹酚对阴沟肠杆菌有较好的抑制效果。

图1 不同含量香芹酚对阴沟肠杆菌的生长抑制作用Fig. 1 Effects of different concentrations of carvacrol on the growth of E. cloacae

2.2 不同含量香芹酚对阴沟肠杆菌的杀菌效果

图2 不同含量香芹酚对阴沟肠杆菌的杀菌效果Fig. 2 Bactericidal effects of different concentrations of carvacrol on E. cloacae

从图2可以看出，当初始菌落数约为3×108CFU/mL时，0.25、0.5、1、2 μL/mL香芹酚溶液均对阴沟肠杆菌有杀菌作用。即使香芹酚含量为0.25 μL/mL时仍可在一定程度上抑制细菌的生长。香芹酚含量为0.5、1、2 μL/mL时菌落数快速下降，并在60～180 min内完全杀死细菌，与空白对照组相比差异明显。

2.3 香芹酚对阴沟肠杆菌细胞形态的影响

图3 经香芹酚处理的阴沟肠杆菌扫描电子显微镜照片Fig. 3 SEM images of E. cloacae cells treated by carvacrol

由图3可知，空白对照组（图3A）细胞圆润饱满、形态完整、表面光滑。0.125 μL/mL处理组（图3B）部分细胞表面产生孔洞并发生褶皱，且细胞呈黏连状态，推测细菌的细胞膜在生长过程中受到损伤。1 μL/mL（图3C）和2 μL/mL（图3D）处理组细胞均出现了严重的干瘪和变形。可以看出香芹酚对阴沟肠杆菌细胞的完整性有极强地破坏作用，并使细胞生长时的形态发生变化。

从图3可以看出，少量的香芹酚就可以在细胞的生长繁殖阶段对其产生影响，使细胞变形，形成孔洞，细胞外壁变得粗糙。随着香芹酚含量的增加，细胞发生更加严重的变形，1 μL/mL和2 μL/mL香芹酚几乎能够溶解菌体。香芹酚破坏了菌体细胞的完整性，并引起细胞膜通透性和菌体形态的改变。推测香芹酚的抑菌机制可能与其理化特性相关。香芹酚可能首先作用于细胞膜，导致细胞膜通透性的增加，使细胞内ATP等物质渗出，影响其生理活性；随后，香芹酚可能进一步穿过细胞膜，进入细胞内部并与细胞器相互作用，以抑制菌体活性。

2.4 胞外ATP化学发光值测定结果

图4 香芹酚处理对阴沟肠杆菌胞内ATP泄漏的影响Fig. 4 Effect of carvacrol on intracellular ATP leakage from E. cloacae cells

图4 中空白对照组样品ATP化学发光值初始时为1 819，培养的3 h中无明显变化。细菌经过香芹酚处理后，各处理组的ATP化学发光值均高于空白对照组；而经过1、2 μL/mL香芹酚处理后，细菌的ATP化学发光值变化明显，尤其是前10 min变化较大。各处理组的ATP化学发光值大幅增加，说明香芹酚处理会使阴沟肠杆菌细胞内的ATP大量流出。由统计分析结果可知，香芹酚含量和ATP化学发光值之间存在极显著的相关性（P＜0.01），即阴沟肠杆菌细胞内ATP的释放是由香芹酚的处理造成的。

细胞内的ATP是储存和提供代谢能量以及细胞内化学反应的重要小分子物质[24]。本实验中香芹酚处理增加了阴沟肠杆菌细胞释放的ATP水平。在0～10 min时，1、2 μL/mL香芹酚处理组的胞外ATP化学发光值变化明显，推测是因为高含量的香芹酚对阴沟肠杆菌有很强的瞬时破坏作用，增加其细胞通透性，使ATP快速流出。随着细菌细胞膜被破坏，细胞制造ATP的能力降低，因此ATP化学发光值也有所下降。而ATP的大量流出也证实了细胞膜的破坏以及胞内物质的流出，说明香芹酚对阴沟肠杆菌具有抑制作用。

2.5 香芹酚处理对阴沟肠杆菌细胞膜内外电势的影响

图5 香芹酚处理对阴沟肠杆菌细胞膜内外电势的影响Fig. 5 Effect of carvacrol on the cell membrane potential of E. cloacae

由图5可知，空白对照组细菌的荧光强度没有明显变化，而不同含量香芹酚处理均会引起阴沟肠杆菌细胞膜内外电势的改变。经香芹酚处理的样品在第1次检测时的结果即明显高于空白对照组，这是由于从加入香芹酚到开始测定需要大约1 min，此时香芹酚已经开始对阴沟肠杆菌产生抑制作用，导致其膜电势改变。由此可知，香芹酚可以在短时间内使阴沟肠杆菌的细胞膜内外电势明显改变。由统计分析结果可知，香芹酚含量和细菌细胞膜内外的电势变化之间存在极显著的相关性（P＜0.01）。

细胞受到损伤时，DiSC3(5)探针从细胞膜上释放，因此能够检测到荧光强度增加。细胞膜电势的变化影响质子进出细胞的动力，阻碍细菌细胞产生ATP，影响小分子物质在细胞内外的交换[25-26]。也有人提出，细胞膜去极化并不是抑菌物质发挥作用的主要方式，但是可以促使抑菌物质进入细胞内部[27]。

2.6 细胞膜完整性观察结果

图6 激光共聚焦显微镜观察阴沟肠杆菌细胞膜的完整性Fig. 6 Observation of cell membrane integrity by laser scanning confocal microscope

如图6所示，细胞膜完整的细胞在染色后呈现绿色荧光，PI则进入细胞膜破损的细胞并将其染成红色。未经香芹酚处理的空白对照组（图6A）细胞样品染色后主要为绿色荧光，而经过0.25、0.5、1 μL/mL和2 μL/mL香芹酚处理1 h后的样品中红色荧光随着香芹酚含量的增加而逐渐增强，说明经过香芹酚处理后阴沟肠杆菌细胞膜遭到破坏，通透性有所增加。

经过两种核酸荧光探针5(6)-cFDA和PI染色后，可区分细胞膜完整的细胞和膜受损细胞。由于PI与细胞内物质的亲和性强于5(6)-cFDA，所以膜受损的细胞在PI进入后导致5(6)-cFDA荧光强度降低。空白对照组几乎均为绿色荧光；而随着香芹酚含量的增加，红色荧光的比例逐渐增加，绿色荧光逐渐减少，2 μL/mL香芹酚处理组视野中几乎均为红色荧光。这也进一步证明了香芹酚能够破坏细菌细胞膜，从而进入细胞内与胞内物质作用[28]。

3 结 论

目前，植物精油的应用受到了广泛的关注和重视。与其他抑菌剂相比，香芹酚具有无毒、安全性高、抗菌性强等优点[29-30]。本研究发现香芹酚对阴沟肠杆菌有较强的抑制效果。推测香芹酚作用于细胞膜，改变膜电势，增加细胞膜通透性，使胞内物质流出，导致细胞功能丧失，从而使细胞失活。

由香芹酚对阴沟肠杆菌的MIC和杀菌效果可以看出，香芹酚对阴沟肠杆菌的抑菌效果与其含量成正比，不同含量的香芹酚对阴沟肠杆菌均存在抑制作用。经香芹酚处理的阴沟肠杆菌菌落数迅速减少，且与对照组相比差异明显。同时，香芹酚接触细胞时，细胞膜内外的电势明显改变，细胞形态被严重破坏。通过激光共聚焦显微镜观察，发现经香芹酚处理的阴沟肠杆菌细胞红色荧光更强，表明其细胞膜的完整性被破坏。因此，香芹酚对阴沟肠杆菌的作用方式主要是通过作用于细菌的细胞膜，破坏细胞膜结构，使细胞膜通透性增加，改变细胞膜内外电势，使ATP等内容物从细胞内渗出，最终表现出杀菌作用。本实验研究不同含量的香芹酚对阴沟肠杆菌的杀菌作用和抑菌机理，为香芹酚应用于阴沟肠杆菌的控制提供一定的理论参考。