Ca（OH）2对银杏叶茶中银杏叶酚酸的影响研究

范维江，唐佳佳，汪洋，贾旭妹

（山东商业职业技术学院食品药品学院，山东 济南 250103）

银杏叶茶是采用一定的工艺将银杏叶制成的保健茶[1-2]。1994 年我国银杏叶茶开始兴起，两湖、江浙、山东等省份均生产银杏叶茶[3]。据不完全统计，全国范围内的银杏叶茶加工厂大约有100 余家，其中山东省20 余家，所占比例最高，年产量最多的厂家不超过5 000 kg，最少的厂家仅500 kg[3]。银杏叶茶厂虽不少，但因为不注重银杏叶的特殊性，使得所制出来的茶叶外形不好看，香气极淡，茶汤无色，滋味苦涩，有效成分损失严重，因此所制的茶叶适口性特别差。

银杏叶中含有的水溶性化学成分大部分都对人体有较显著的保健作用[4]，如果能时常饮用，能有效抗衰老和抗氧化，并且在治疗和预防心脑血管疾病方面有一定的效果，谭志鑫的研究说明银杏叶茶具有保护缺血-再灌注损伤时心肌的收缩和舒张功能，从而有效地保护了心脏的舒缩活动[5]。许秀举等[6]通过测定实验小鼠胃组织超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），说明银杏茶对于酒精所引起的超氧化物歧化酶的损伤具有非常明显的保护作用。

银杏茶中的银杏酚酸具有致敏性、致细胞毒性成分，让广大消费者望而却步[7]。未经处理的银杏叶中含有较高的银杏酚酸[8]，银杏酚酸具有独特的药理活性日益受到人们的广泛关注[9]。但是银杏酚酸对人体有毒副作用，会产生肌肉抽搐、瞳孔放大等症状[10]。有研究报道[11-13]，以利用超临界CO2不仅可以选择性地萃取出银杏叶中的银杏酚酸，而且对其中的有效成分黄酮和内酯无影响，保持了银杏叶茶良好的口感。廖贤军等冷冻后发酵可降低银杏叶中银杏酚酸的含量，改善银杏叶茶的口感和风味[7]。

本研究以银杏叶为研究对象，参照绿茶的加工工艺制备银杏叶茶，制作过程中添加不同剂量的Ca（OH）2，以水浸出物含量、游离氨基酸含量、过氧化物酶（peroxidase，POD）活性、黄酮类化合物含量等主要功能成分以及感官评价作为评价指标，研究Ca（OH）2的投入量对银杏叶茶中银杏叶酚酸的影响情况。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试验原料

银杏叶，叶长约为5 cm～9 cm，淡黄色，无虫坏，采摘于山东商业职业技术学院校园。

1.1.2 主要试剂

甲醇：天津市科密欧化学试剂有限公司；氯化亚锡、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠（均为分析纯）：天津市广成化学试剂有限公司；茚三酮、氢氧化钙、95%乙醇（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；植物型POD试剂盒：南京建成生物工程研究所；银杏酸C15∶1：中国药品生物制品鉴检定所。

1.1.3 主要仪器

UV754N 紫外可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；RE-52AA 旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；SHK-III 循环水式多用真空泵：郑州科泰实验设备有限公司；ME204E/02 型电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；DZKW 电热恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器厂；BGZ-30 电热鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司；UPLC I-Class 高效液相色谱仪：美国waters 公司。

1.2 试验方法

工艺流程：原料处理→萎凋→漂烫杀青→揉捻→干燥→分拣包装。

1.2.1 样品的制备

处理鲜叶时，应先将病虫叶、杂质等剔除，然后剪去叶柄。银杏叶清洗2 次～3 次，沥干水分，均匀摊在桌上晾晒，使叶子完全枯萎，再进行杀青、揉捻。

取萎凋处理好的银杏叶50 g，分别添加0.32、0.4、0.48 g 的 Ca（OH）2，在设置温度为 90 ℃的水浴锅里杀青4 min，取出后清洗3 次以除去叶面上的Ca（OH）2残留。然后摊凉，揉捻，干燥。摊晾入袋后分别贴上标签 D1，D2，D3。

1.2.2 银杏叶茶的感官评价

取成茶3 g，分别用150 mL 的沸水冲泡5 min，将编号遮挡，请10 位同学品评后，对茶的外形、汤色、香气、滋味进行打分，每项满分为10 分，然后使用加权法计算总分（总分=外形×0.1+汤色×0.3+香气×0.3+滋味×0.3），最后取平均值。银杏叶茶成茶感官评定细则见表1。

表1 银杏叶茶成茶感官评定细则Table 1 Rules for sensory evaluation of ginkgo leaf tea

1.2.3 水浸出物含量的测定

将瓷坩埚连同15 cm 的定性快速滤纸置于（120±2）℃的恒温干燥箱中烘干1 h，干燥器中冷却至25 ℃，直至恒重（前后两次称重之差小于0.2 mg）。称量2.000 g 磨碎试样，加沸蒸馏水300 mL，沸水浴中浸提45 min（每10 min 摇动一次），浸提完毕后趁热减压过滤，用约150 mL 的沸蒸馏水洗涤茶渣数次。茶渣和滤纸移入坩埚置于120 ℃烘干1 h。取出后，冷却1 h 后再烘干，冷却至室温后称重，直至恒重后，可求得水浸出物含量[14]。

式中：m1为干燥后茶渣质量，g；m0为试样质量，g；w 为试样干物质含量，%。

1.2.4 游离氨基酸含量的测定

称取2 g 茚三酮、80 mg 氯化亚锡溶于50 mL 蒸馏水中，分次加少量水溶解，于暗处静置24 h，过滤后定容至100 mL 待用。在比色管中加入0.5 mL，pH8.0 的磷酸缓冲液，0.5 mL 茚三酮和1 mL 试样，沸水浴5 min，冷却后定容至25 mL，放置10 min 后，用3 mm 的玻璃比色皿于570 nm 处测定吸光度，用试样空白溶液作为参比[15]。

式中：C 为所测得的吸光度从标准曲线上查得的谷氨酸的毫克数，mg；V1为试液总量，mL；V2表示测定用试液量，mL；m 为试样用量，g；w 为试样干物质含量，g。

1.2.5 POD 酶活性的测定

采用过氧化物酶（POD）试剂盒测定银杏叶茶中的POD 酶活性。其测定原理是利用过氧化物酶（POD）催化过氧化氢反应的原理，通过测定420 nm 处吸光度的变化得出其活性。

称取银杏叶茶1.0 g 放入研钵中，加入匀浆介质9 mL（0.1 mol/L pH 7.0～7.4 的磷酸盐缓冲液），冰水浴条件下制备成10%的组织匀浆液，然后转入15 mL 离心管中，使用离心机3 500 r/min 离心10 min，取上清液。具体操作见表2。

表2 POD 酶活性测定操作表Table 2 Operation table for determination of POD enzyme activity

混匀后，再使用离心机3 500 r/min 离心10 min，取上清液于波长420 nm 处，1 cm 光径，调零后测定各吸光度。

1.2.6 黄酮类化合物和银杏叶酚酸的测定

取10 mg 银杏酸标准品用色谱纯甲醇溶解定容至100 mL，得浓度为 100 μg/mL 标准品溶液[16]。

称取5.0 g 样品，粉碎后溶于50%的乙醇，然后在80 ℃条件下水浴5 h，水浴过程中需要不停搅拌[17]。将水浴后的样液抽滤后滤渣用50%的乙醇再提取1 h，重复两次。将3 次抽滤所得的提取液混合后旋转蒸干至3 mL～5 mL，真空冷冻干燥机冻干，备用。取0.2g 冻干样品，加入 10 mL 甲醇，涡旋 1 min，超声 5 min 后，取100 μL 加入 900 μL 甲醇水稀释，用 0.22 μm 滤膜过滤，取0.5 mL 滤液加入0.5 mL 1%甲醇水[18]。使用高效液相色谱仪测定银杏叶茶中银杏酸和芦丁含量[19-20]。

2 结果与分析

2.1 不同Ca（OH）2投入量对银杏叶茶的感官影响

不同Ca（OH）2投入量时银杏叶茶的感官评价结果见表3。

表3 不同Ca（OH）2 投入量时银杏叶茶的感官评价结果Table 3 Sensory evaluation of different addition of Ca（OH）2 in Ginkgo biloba leaf tea

由表3可知，漂烫杀青时Ca（OH）2投入量不同对银杏叶茶的颜色、质地、气味均有影响。当Ca（OH）2的投入量为0.32 g 时，成茶的质地、气味效果较差，而当Ca（OH）2投入量为 0.4 g 时，成茶的颜色、质地、气味均是最佳，银杏叶成茶的感官评价分值最高。

2.2 对水浸出物含量的影响

浸出物含量的高低反映了茶叶中可溶性物质的多少，标志着茶汤的厚薄、滋味的浓强程度，从而在一定程度上还反映茶叶品质的优劣。不同Ca（OH）2投入量对银杏叶茶水浸出物含量的影响如图1所示。

图1 Ca（OH）2 投入量变化对水浸出物含量的影响Fig.1 Effect of different levels of Ca（OH）2 for the content of water extract

当Ca（OH）2的投入量增加时，银杏叶茶的水浸出物含量也相应增加，说明Ca（OH）2投入量增加引起水浸出物含量的增加，并呈一定的剂量-反应关系。当Ca（OH）2投入量为0.48 g 时，水浸出物含量值最高。

2.3 对游离氨基酸含量的影响

茶叶中氨基酸的组成、含量以及组分间的含量变化直接影响到茶叶的香气和滋味，对银杏叶成茶的品质具有重要作用。不同Ca（OH）2投入量对银杏叶茶游离氨基酸的影响如图2所示。

图2 Ca（OH）2 投入量变化对银杏叶茶游离氨基酸的影响Fig.2 Effect of different levels of Ca（OH）2 for free amino acids in ginkgo leaf tea

Ca（OH）2投入量与银杏叶成茶的游离氨基酸含量成反向关系，并呈一定的剂量-反应关系。加入的Ca（OH）2质量增加时，银杏叶茶游离氨基酸含量就相应降低。当加入的 Ca（OH）2含量为 0.4 g 及 0.48 g 时，二者游离氨基酸含量差别不大。

2.4 对POD酶活性的影响

制茶工艺的高温破坏鲜叶中过氧化物酶的活性，抑制多酚类物质的氧化，直接影响风味的形成。不同Ca（OH）2投入量对银杏叶茶POD 酶活性的影响如图3所示。

图3 Ca（OH）2 投入量变化对银杏叶茶POD 酶活性的影响Fig.3 Effect of different addition amounts of Ca（OH）2 for POD activity in ginkgo leaf tea

当Ca（OH）2的投入量为0.32 g 时，银杏叶茶的POD 酶活性最高，即银杏叶茶POD 酶的活性较另两种条件而言，没有被明显抑制，对银杏叶茶的香气滋味有不利的影响。试验结果表明，Ca（OH）2投入量的增加可以降低银杏叶茶的POD 酶活性。

2.5 对黄酮类化合物的影响

图4为银杏酸及芦丁标准品的色谱分析结果。

D1的色谱分析图见图5。

图4 银杏酸及芦丁标准品的色谱分析图Fig.4 Chromatographic assayof ginkgolic acid and rutin trihydrate standard

图5 D1 的色谱分析图Fig.5 D1 Chromatographic analysis

制茶过程中，添加 0.32 g Ca（OH）2时，芦丁含量为0.003 mg/mL，银杏酸未检出。

D2的色谱分析图见图6。

当 Ca（OH）2的投入量为 0.40 g 时，芦丁含量为0.001 mg/mL，银杏酸含量为0.002 mg/mL。

D3的色谱分析见图7。

图6 D2 的色谱分析图Fig.6 D2 Chromatographic analysis

图7 D3 的色谱分析图Fig.7 D3 Chromatographic analysis

当 Ca（OH）2的投入量为 0.40 g 时，芦丁含量小于0.001 mg/mL，银杏酚酸未检出。

综上试验结果表明，在制茶过程中加入Ca（OH）2后，银杏叶茶的芦丁含量结果相差不大，其含量范围在 0.001 mg/mL～0.006 mg/mL 之间。而加入 Ca（OH）2后，银杏叶茶中银杏酸含量均≤0.006 mg/mL，小于规定限量，可能是银杏叶酚酸与Ca（OH）2生成了对人体有益的银杏叶酚酸钙。

3 结论

本研究在制作银杏叶茶过程中，加入Ca（OH）2对银杏叶茶的滋味、香气、汤色、外形均有影响，加入Ca（OH）2所制得的成茶感官评价的分值比未加Ca（OH）2的分值高，当加入的Ca（OH）2含量为0.4 g 时，银杏叶成茶的感官评价分值最高；但是加入Ca（OH）2对银杏叶茶的芦丁含量影响不大，其含量范围在0.001～0.006 之间；与此同时，加入Ca（OH）2的银杏叶茶中银杏叶酚酸均为未检出，我们推测银杏叶酚酸与Ca（OH）2发生反应生成了对人体有益的银杏叶酚酸钙，这也是加入Ca（OH）2所制得成茶感官评价较高的原因之一，这一结果有待进一步研究验证。