乳酸菌L-SZ303发酵产γ-氨基丁酸条件的优化

王冰聪，吴琼，迟燕平

（1.长春大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130022；2.吉林省农业科学院农产品加工所，吉林 长春 130124）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA），又称4-氨基丁酸、氨酪酸，是一种非蛋白质组成的天然氨基酸，分布非常广泛[1]，是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质[2]，具有很多重要的生理功能，如控制高血压[3]，治疗癫痫病，延缓衰老，增进脑活力[4]，安定神经[5]，改善一系列保健和生理功能，如更年期综合症[6]。如今GABA 已经发展成为一种新型的功能性因子[7]，被大量的利用在农业、林业、工业等领域中[8-10]。制备GABA 的方法主要包括化学合成和生物合成两大类。化学合成法反应速率快，但副产物较多，成本高，安全性低[11]。生物合成法是基于L-谷氨酸及其钠盐或富含谷氨酸的物质，并且通过利用食品安全级的微生物如乳酸菌、曲霉菌和酵母菌等的发酵来生产[12]，其产品具有产量高，成本低，安全性高的优点。

在本研究中，以在前期工作中筛选得到一株高产GABA 的乳酸菌L-SZ303 为研究对象，通过单因素试验和响应面法对其产GABA 的发酵工艺条件进行优化，从而提高GABA 产量。用米糠作为发酵培养基的氮源，为规模化利用廉价农副产品生产食品奠定基础，对于GABA 的发酵生产具有参考意义。

1 材料与方法

1.1 菌株、试剂与仪器

乳酸菌菌株：农产品加工所实验室保藏乳酸菌菌株L-SZ303。储存条件为，在琼脂斜面保藏培养基上传代，保存于4 ℃冰箱，每两周转接一次[13]。

GABA 标样（≥99.9%）：Sigma 公司；L-谷氨酸钠：中国医药集团；米糠：农村饲料；其他试剂均为国产分析纯。

T-6vm 型分光光度计：南京菲勒仪器有限公司；HZQ-QX 全温振荡器：哈尔滨东联电子技术开发有限公司；3K15 高速离心机：Sigma 公司。

1.2 培养基

菌株斜面保藏培养基：酪蛋白胨10 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母粉5 g/L、葡萄糖5 g/L、乙酸钠5 g/L、吐温-80 10 mL、柠檬酸铵2 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰 0.05 g/L，琼脂 15 g/L，pH 6.6～6.8[14-15]。

发酵培养基（TYG 培养基）：胰蛋白胨5 g/L、酵母粉5 g/L、葡萄糖10 g/L、丁二酸钠5 g/L、L-谷氨酸钠10 g/L，pH 6.6～6.8[16]。

1.3 方法

1.3.1 发酵培养

将菌株L-SZ303 接入MRS 液体培养基中，放入35 ℃的培养箱中进行摇培16 h，然后按2%（体积分数）的接种量接入TYG 液体培养基中进行发酵试验，35 ℃摇培发酵72 h。

1.3.2 定性定量分析

发酵液中GABA 定性：薄层层析法，展开剂组成为正丁醇∶冰醋酸∶水=4∶1∶3（体积比），0.4%的茚三酮作为显色剂加入展开剂中，分别配制GABA 标准品和L-谷氨酸钠1 g/L 用于定性参比，距离层析板底1 cm 点样2 μL（直径不超过4 mm），于层析缸中展开，然后于90 ℃下显色10 min[17]。

发酵液中GABA 定量：Berthelot 比色法，在0.5 mL离心稀释40 倍后的发酵液中加入0.2 mL 0.2 mol/L 硼酸盐缓冲液（pH9.0），1 mL 6%苯酚和0.4 mL 9%次氯酸钠。剧烈振荡后，将混合物置于沸水中10 min，然后置于冰浴中20 min，并继续振荡直至出现蓝色。最后，向混合物中加入2 mL 60%乙醇，并在645 nm 波长下测定其光密度值（OD645 nm）[18]。

1.3.3 正交试验优化培养基

在对乳酸菌L-SZ303 发酵特性的初步了解基础上，安排六因素三水平正交试验L27（36）研究葡萄糖、胰蛋白胨、丁二酸钠、酵母粉、米糠、L-谷氨酸钠对发酵产GABA 的影响，确定最佳的培养基配方。

1.3.4 优化培养条件

1.3.4.1 响应面法优化培养条件

以初始pH 值，发酵温度以及发酵时间3 个因素为自变量，以GABA 为响应值，进行响应面试验设计，确定最优的发酵条件。

1.3.4.2 模型验证

通过响应面法优化乳酸菌L-SZ303 产GABA 发酵培养条件进行发酵试验，比较模型预测值和试验值，验证模型的有效性。

1.3.4.3 数据分析

采用Design Expert 7.0 软件设计三因素三水平响应面分析试验，试验结果采用Design Expert 7.0 软件进行数据处理和分析，确定最佳培养条件。

2 结果与分析

2.1 发酵培养基的确定

在单因素试验的基础上，将GABA 发酵培养基的6 种成分：葡萄糖、胰蛋白胨、丁二酸钠、酵母粉、米糠、L-谷氨酸钠，分别作为正交试验的6 个因素，安排三水平正交试验L2（736），因素和水平设计见表1，正交试验结果见表2，方差分析见表3。

表1 正交设计的因素和水平取值表Table 1 Orthogonal design factors and level values

表2 正交试验结果表Table 2 Orthogonal design results table

续表2 正交试验结果表Continue table 2 Orthogonal design results table

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis table

由方差分析可知，葡萄糖、胰蛋白胨、米糠、酵母粉、L-谷氨酸钠均极显著。由表2可知，6 个因素对发酵液中GABA 含量的影响大小依次为葡萄糖＞胰蛋白胨＞米糠＞酵母粉＞L-谷氨酸钠＞丁二酸钠，即培养基中葡萄糖和胰蛋白胨对GABA 的生成影响较为显著，米糠次之，酵母粉，L-谷氨酸钠和丁二酸钠的影响程度相差不大。由表2可知6 个因素的最佳组合为A3B3C2D3E3F3，由于最佳条件不在这27 次试验中，所以做3 次验证试验A3B3C2D3E3F3取均值后得到GABA的含量为11.367 g/L，与最好的8 号试验进行比较高于8号试验，由此得最佳的培养基组成配方为：葡萄糖15 g/L，胰蛋白胨25 g/L，丁二酸钠2 g/L，酵母粉6 g/L，米糠6 g/L，L-谷氨酸钠5 g/L。

2.2 培养条件的确定

根据Box-Behnken 的中心组合设计原理，设计了三因素三水平的响应面分析（response surface methodology，RSM）试验，共有17 个试验点，以培养基初始pH值、发酵温度、发酵时间3 个因素为自变量，以GABA含量为响应值，试验因素与水平的选取见表4。

表4 响应面分析的因素和水平取值表Table 4 Factors and levels of response surface analysis

17 组试验可分为两类：1～12 是析因试验，13～17是中心试验，用以估计试验误差，响应面分析试验安排及每次试验得到的GABA 的含量（g/L）见表5，回归分析见表6。

表5 Box-Behnken 试验设计及响应值Table 5 Box-Behnken test design and response values

表6 方差分析表Table 6 Analysis of variance

根据试验结果，通过响应面分析软件分析数据，以GABA 产量为响应值，得到回归方程表达为：Y=13.38+0.086X1+0.18X2+0.1X3-0.11X1X2-0.031X1X3-4.0×10-3X2X3-0.25X12-0.91X22-0.21X32。

由方差分析得出P 值，模型极显著，模型的失拟性不显著，回归决定系数R2=0.985 2，修正决定系数R2Adj=0.966 2，说明方程具有良好的拟合性，可以应用于对发酵条件优化的分析预测。根据结果进行分析：一次项 X1、X2、X3显著。由表6可知，影响 GABA 产量的因素由大到小排序依次是发酵温度、发酵时间、初始pH 值。发酵条件交互因素响应面立体分析见图1。

数据分析表明回归模型存在最大值，最佳发酵条件为：初始pH6.83、发酵温度36.27 ℃、发酵时间3.23 d，此条件下理论预测最大值为13.403 4 g/L。由于实际情况，取发酵条件为：初始pH6.8、发酵温度36 ℃、发酵时间3 d 进行3 次验证试验取平均值得GABA 产量为13.375 g/L，基本与预测值一致。

图1 发酵条件交互因素响应面图Fig.1 Fermentation condition interaction factor response surface diagram

3 结论

通过正交试验和响应面的试验设计，以GABA 产量为指标，采用比色法对发酵中GABA 含量进行测定，优化了乳酸菌L-SZ303 产GABA 发酵培养基及其发酵条件。确定了乳酸菌L-SZ303 产GABA 的最佳培养基配方：葡萄糖15 g/L，胰蛋白胨25 g/L，丁二酸钠2 g/L，酵母粉 6 g/L，米糠 6 g/L，L-谷氨酸钠 5 g/L。最适发酵条件：初始pH6.8、发酵温度36 ℃、发酵时间3 d。试验结果有良好的重现性，GABA 产量达13.375 g/L。