刺梨果渣多糖的发酵制备工艺优化及其抗氧化活性研究

周笑犁，卢颖，朱坤珑，王金华，杜斌，林栋

（贵阳学院食品与制药工程学院，贵州省果品加工工程技术研究中心，贵州 贵阳 550005）

刺梨（Rosa roxburghii Tratt）属于蔷薇属植物[1]，主要在西南地区有分布，其中贵州地区的刺梨产量尤为突出[2]。刺梨鲜果中有着丰富的维生素、多糖、有机酸、酚类、氨基酸和微量元素等营养成分[3-4]。多糖除具有调节免疫、抗肿瘤的生物学效应外，还有着降血糖、抗衰老等功效，而且对机体的副作用较小，因此多糖的开发成为了功能食品乃至新药制品中极具发展潜力的方向[5-7]。刺梨作为贵州省药食两用资源被大力研究并开发的果品之一，其刺梨多糖是鲜果中主要的一种水溶性成分，杨江涛[6]报道了刺梨粗多糖具有提高衰老小鼠体内抗氧化的能力；陈代雄等[8]发现刺梨多糖可以增强动物的非特异性免疫和体液免疫应答；崔昊等[9]也发现刺梨多糖对补体途径和替代途径均有着积极的作用；而关于刺梨多糖的提取分离方面，分别用热水浸提、微波法、超声法、酶法4 种提取方法对所提取的刺梨多糖的理化性质进行比较[10-11]，对刺梨多糖的纯化主要在分级沉淀、柱层析等[6]。由于多糖自身的结构较复杂、种类较多，其提取液中还含有寡糖、胶体等物质[12]。在本试验中主要以刺梨加工副产物——果渣为试材，若采用耗时较长且工艺繁琐的纯化工艺必然会增加果品副产物再开发的成本，因此本研究在前期热水浸提法对刺梨果渣多糖提取工艺的基础上，加入安琪酵母菌进行发酵，菌种在生长和代谢的过程中会利用单糖、双糖等小分子糖，还可将一些组分进行转化并产生活性代谢产物，从而达到制备刺梨果渣多糖并提高其活性的目的[12-13]，该发酵法作为初步的纯化耗能较低、操作简易。通过探讨液态发酵法制备刺梨果渣多糖的最佳工艺，可为刺梨果渣多糖的进一步开发应用提供理论基础，为刺梨的综合利用，尤其是果渣多糖等功效产品开辟新途径。

随着生活节奏的增加，环境的变化以及年龄的增长，机体在活动和代谢过程中会产生较多的氧自由基，但对于健康机体而言其维持着一定的平衡关系，当其平衡被打破后则有着较强的破坏性，对机体的生物膜系统造成损伤[14]，导致慢性疾病的发生。因此从天然资源中提取多糖等功效组分作为自由基清除剂，尤其从果蔬废弃资源中提取活性成分，不仅能够提高果蔬资源的综合利用，还为食品添加剂的研制及进一步推广应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

刺梨果渣：贵州省果品加工工程研究中心开发刺梨饮品加工后的副产物，经微波真空干燥至恒重，粉碎，制成刺梨果渣粉，备用。

安琪酵母：安琪酵母股份有限公司；蒽酮、浓硫酸、葡萄糖、柠檬酸钠、无水乙醇、DPPH、硫酸亚铁、氢氧化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁均为国产分析纯。

LDZX-30KBS 高压灭菌锅：上海申安有限公司；TGL-16C 高速台式离心机：北京市永光明医疗仪器厂；SPX-250B-Z 生化培养箱：上海博讯实业有限公司；UV-2550 紫外分光光度计：日本岛津公司；SW-CJ-1G 超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 刺梨果渣多糖液及发酵原液的准备

通过前期研究热水浸提法对果渣多糖的提取工艺[料液比 1∶20（g/mL），60 ℃恒温水浴浸提 2 h]制备刺梨果渣多糖液。

发酵原液[13]：在100 mL 刺梨果渣多糖液中加入1 g葡萄糖、1 g 蛋白胨和0.5 g 酵母膏，115 ℃灭菌15 min后用于酵母发酵工艺的研究。

1.2.2 发酵菌种的制备

取安琪酵母菌进行培养，用血球计数板计数，其菌数含量为 106个/mL～107个/mL。

1.2.3 单因素试验

1.2.3.1 接种量对果渣多糖含量的影响

分别加入1%、2%、3%、4%、5%酵母菌种液到刺梨果渣多糖原液中，30 ℃培养60 h，pH 5.0，考察接种量对发酵液中多糖含量的影响。

1.2.3.2 发酵时间对果渣多糖含量的影响

刺梨果渣多糖发酵原液中加入3%酵母菌种液，pH 5.0，于 30 ℃培养箱中分别培养 48、60、72、84、96 h，考察发酵时间对发酵液中多糖含量的影响。

1.2.3.3 pH 值对果渣多糖含量的影响

刺梨果渣多糖发酵原液中加入3%的酵母菌种液，于 30 ℃培养箱中培养 60 h，pH 值分别为 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，考察初始pH 值对发酵液中多糖含量的影响。

1.2.3.4 发酵温度对果渣多糖含量的影响

刺梨果渣多糖发酵原液中加入3 %的酵母菌种液，pH 5.0，分别在 25.0、27.5、30.0、32.5、35.0 ℃条件下培养60 h，考察温度对发酵液中多糖含量的影响。

1.2.4 正交试验

在单因素试验基础上，以发酵液中多糖含量为指标，L9（34）正交试验进行优化，如表1所示。

表1 刺梨果渣多糖发酵法制备正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.5 验证试验

由正交试验分析所确定的贵州产刺梨果渣多糖的酵母发酵法工艺参数进行验证试验。

1.2.6 多糖含量的测定

采用蒽酮-硫酸显色法[15-16]测定，以吸光度值为纵坐标，葡萄糖标准液质量浓度为横坐标，得到方程y=0.026 2x+0.000 2，相关系数R2=0.991 4。通过该线性方程计算发酵液中多糖的含量。

1.2.7 刺梨果渣多糖的制备

对酵母菌发酵制备的刺梨果渣多糖进行浓缩处理，然后加入无水乙醇进行醇沉过夜[17-18]，离心分离干燥后制得刺梨果渣多糖（即刺梨果渣多糖A）。

将刺梨果渣多糖A 中加入无水石油醚进行脱脂处理，重复3 次。然后采用Sevag 法脱蛋白[17-18]。最后得到的多糖液加入乙醇进行醇沉，重复3 次以除去Sevag 试剂，最后得到脱脂脱蛋白的刺梨果渣多糖（即刺梨果渣多糖B）。

1.2.8 抗氧化性分析

1.2.8.1 还原能力的测定

分别取不同浓度的果渣多糖样品，依次加入0.2 mol/L 的磷酸盐缓冲液2.5 mL 和1 %六氰合铁酸钾溶液2.5 mL，50 ℃下反应20 min，快速冷却再加入10%三氯乙酸2.5 mL，混匀，3 000 r/min 离心10 min，依次加入蒸馏水2.5 mL 和0.1%三氯化铁溶液0.5 mL到上清液中，混合均匀后静置10 min，测定700 nm 波长处的吸光值[19]。

1.2.8.2 DPPH 自由基的清除作用

用无水乙醇溶解1 mg DPPH 后定容至25 mL 用作母液，然后吸取DPPH 母液2 mL 定容至100 mL，分别吸取DPPH 溶液2 mL 和2 mL 乙醇或不同浓度的果渣多糖样品，用力摇匀，避光反应30 min，以乙醇作为空白，在波长517 nm 处测定其吸光值；DPPH 溶液2 mL 和乙醇2 mL 的吸光度记为A0；多糖样品液2 mL与DPPH 溶液2 mL 混合后以同样的方法测定其吸光值记为Ai；乙醇2 mL+多糖样品液吸光值2 mL 为Aj。清除率/%=[A0-（Ai-A）j]/A0×100[20-21]。

1.3 数据统计分析

试验数据用平均值±标准差表示。用SPSS 软件进行统计分析，以p＜0.05 作为差异显著性的判断标准。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 接种量对多糖含量的影响

接种量对多糖含量的影响见图1。

图1 接种量对多糖含量的影响Fig.1 Effects of inoculating volume on the polysaccharide yield

如图1所示，随着酵母菌接种量的增加多糖的含量呈逐渐上升的趋势。接种量为1%时多糖含量显著低于其他各组（p＜0.05）；当接种量为3%时多糖的含量最高（p＜0.05）；接种量大于3%时，其含量则呈下降趋势（p＞0.05）。这可能是由于酵母菌接种量较低时菌种和原料接触不充分，而接种量过大则导致在有限的营养物质下酵母菌生长受到限制，从而致使后续发酵制备动力的不足，也可能由于菌种的不断增殖产生了次级代谢产物，而产物的不断积累缺抑制了试验菌种的正常生长[12-13]，故选择3%、4%和5%的接种量作为正交试验的3 个水平。

2.1.2 发酵时间对多糖含量的影响

发酵时间对多糖含量的影响见图2。

图2 发酵时间对制备多糖含量的影响Fig.2 Effects of fermentation time on the polysaccharide yield

发酵时间的逐渐延长，发酵液中多糖的含量逐渐降低后有回升的趋势，但各组间多糖的含量均差异不显著（p＞0.05）。说明酵母菌在生长的过程中主要以单糖和双糖为优势碳源，而对三糖的利用则因酵母菌的种类不同而存在着一定的差异[12]，本试验中可能由于刺梨果渣多糖发酵液中酵母菌在48 h 已趋于稳定，因此后续发酵相对平缓，致使多糖含量的变化没有显著性差异（p＞0.05）。选择多糖含量值最高的3 组即48、84 h 和96 h 的发酵时间作为下一步正交试验的3 个水平。

2.1.3 初始pH 值对多糖含量的影响

pH 值对多糖含量的影响见图3。

随着pH 值的增加，酵母发酵制备多糖的含量逐渐增加（p＜0.05），直到 pH 值大于 6.0 时多糖的含量显著低于其他各组（p＜0.05），这可能是因为酵母菌适宜在偏酸性环境生长的原因，在pH 值为中性时的发酵原液则影响了酵母菌细胞质膜电荷及其稳定性和菌体的代谢酶活性，从而改变了酵母菌对发酵液中营养物质的吸收利用情况。在pH 值为5.0 时，酵母菌的生长情况最佳，其多糖含量显著高于其他各组（p＜0.05）。

图3 pH 值对多糖含量的影响Fig.3 Effects of pH value on the polysaccharide yield

2.1.4 发酵温度对多糖含量的影响

发酵温度对多糖含量的影响见图4。

图4 发酵温度对多糖含量的影响Fig.4 Effects of fermentation temperature on the polysaccharide yield

由于酵母菌属于真核微生物，故取25 ℃～35 ℃作为制备工艺的温度优化范围。如图4所示，该温度区间较适合进行酵母菌发酵多糖，多糖含量在30 ℃时达到最大（p＜0.05），说明更利于酵母利用小分子的糖类。温度在25 ℃～30 ℃时，发酵制备液中多糖的含量随温度的升高而逐渐增加，可能是缘于该温度范围不能达到酵母菌的最适生长温度，从而使得酵母菌利用单糖的能力较低；当温度30 ℃～35 ℃时，发酵制备液中多糖的含量却缓慢降低，可能是该温度不利于酵母菌自身的生长，从而导致代谢活性不高。

2.2 正交试验

通过对酵母菌发酵法制备贵州产刺梨果渣多糖的酵母菌种添加量、发酵液起始pH 值、发酵时间和发酵温度4 个因素进行单因素分析后，对较优的3 个水平进行正交试验，见表1。试验结果及直观分析见表2，对贵州产刺梨果渣多糖的酵母发酵法制备主次顺序A＞D＞C＞B，即菌种接种量＞pH 值＞发酵时间＞发酵温度；并得出酵母发酵制备果渣多糖的最适工艺条件为A1B3C2D1，即酵母菌液的添加量为3%，发酵温度为32.5 ℃，发酵时间为 84 h，发酵起始 pH 为 4。

表2 正交试验结果分析表Table 2 The orthogonal experiment results analysis table

2.3 验证试验

本试验利用酵母菌生长过程中会利用多糖原液中的单糖、双糖等[12]，使得果渣多糖的纯度提高，这为后期刺梨果渣废弃物开发工艺奠定了基础。通过正交试验确定酵母菌发酵法制备果渣多糖的最优工艺条件进行验证试验，由3%酵母菌液添加到刺梨果渣多糖发酵原液中，pH 值为4，在32.5 ℃的培养箱进行发酵纯化84 h，得到刺梨果渣多糖的含量为（3.19±0.1）mg/mL，均高于正交试验中各组的多糖含量。

2.4 酵母发酵纯化刺梨果渣多糖的抗氧化活性

2.4.1 还原能力

刺梨果渣多糖的还原能力见图5。

图5 刺梨果渣多糖的还原能力Fig.5 The reducing power of polysaccharides extracted from Rosa roxburghii Tratt residue

不同浓度的各组刺梨果渣多糖均具有还原能力，并且有着一定的剂量依赖关系，随着浓度的增加，还原能力逐渐增大（p＜0.05）。经过发酵制备的刺梨果渣多糖将Fe3+还原为Fe2+的能力优于多糖原液，尤其在0.5、1.0 mg/mL 时显著增加（p＜0.05）；而与唐健波等[10]报道的微波、超声法提取刺梨多糖的还原能力相比，0.1、0.5 mg/mL 发酵制备多糖较优，但低于张汇慧[22]报道的刺梨黄酮的还原能力，并且，对发酵制备多糖进行脱脂脱蛋白处理后（刺梨果渣多糖B）的还原能力均显著高于其他各组（p＜0.05）；说明经过酵母菌制备的多糖具有良好的还原能力。

2.4.2 对DPPH 自由基清除能力

刺梨果渣多糖对DPPH 自由基的清除能力见图6。

图6 刺梨果渣多糖对DPPH 自由基的清除能力Fig.6 The DPPH radical scavenging effect of polysaccharides extracted from Rosa roxburghii Tratt residue

本试验中多糖原液、发酵制备多糖（A）及其脱脂脱蛋白后的多糖（B）对DPPH 自由基的清除能力分别为60 %、70 %和80 %左右，且发酵前后差异显著（p＜0.05），说明多糖对自由基的清除能力与其纯度有关，纯度越大清除能力越强；或者利用微生物对多糖原液进行发酵的过程中产生了一些次级代谢产物，而这些代谢产物也有一定的抗氧化能力[13]，本试验的结果与铁皮石斛发酵制备所得多糖的抗氧化活性更强相似[13]。发酵制备多糖对DPPH 自由基清除能力优于5 mg/mL 薏苡仁多糖液[23]，低于 1 mg/mL 紫甘薯花色苷[24]、0.08 mg/mL 蓝莓酒渣花色苷[25]及刺梨黄酮[22]对DPPH 自由基的清除率，说明刺梨果渣多糖的抗氧化作用弱于花色苷等活性物质。另外，随着多糖原液和发酵液浓度的增加，其自由基清除率增大，但差异不显著（p＞0.05），经过脱脂脱蛋白发酵多糖的清除率达到最大（p＜0.05），可能由于多糖原液样品中所含的蛋白质或脂类阻碍了对自由基的清除效果。

3 结论

本试验在单因素试验（接种量、起始pH 值、发酵时间和温度）的基础上，通过L9（34）正交试验选出采用安琪酵母菌发酵法制备贵州产刺梨果渣多糖的工艺条件，即为菌种的接种量3%、初始pH 值为4、发酵温度32.5 ℃的条件下培养84 h。在试验浓度范围内，对还原能力和DPPH 自由基的清除率随着贵州产的刺梨果渣多糖浓度的增大而逐渐升高，并且发酵法制备的多糖其抗氧化能力强于多糖原液，说明经过发酵可以提高体外抗氧化活性，从而为果渣多糖的进一步推广应用提供了依据。因此刺梨果渣发酵制备多糖作为天然抗氧化剂或膳食添加剂的开发使用，不仅缓解了资源的浪费和环境的污染，而且制备工艺简单、成本低廉，对于刺梨果渣等果蔬加工副产物的综合开发及新型食品的研制有着一定的应用价值。