液体样品中雌激素活性物质检测方法概述

唐语谦，王谙，朋贤，余以刚，李晓凤，*

（1.华南理工大学食品科学与工程学院，广东 广州 510640；2.华南理工大学制浆造纸国家重点实验室，广东 广州 510640）

雌激素及雌激素类化合物是广泛存在于人体、家禽、农产品、废水处理厂、工业生产厂及自然环境中的一种类固醇类物质，主要可分为环境雌激素和内源性雌激素。雌激素具有促进雌性动物第二性征发育及性器官成熟等生理作用，也是脂质代谢、炎症和血管各指数稳定的重要调节剂。研究表明内源性雌激素可以有效降低绝经前女性动脉粥硬化性血管疾病的发生，绝经后的女性通过雌激素药物维持体内的雌激素水平可以有效降低心血管类疾病的风险[1]。但同时，雌激素及雌激素类化合物在机体内的代谢、运转和积累都会对人类健康、动植物安全性造成一系列的问题，包括引起小孩的性早熟、生理功能发育异常及引发成人的乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和生殖异常等。

在关于雌激素及其代谢物对绝经前和绝经后的女性的作用研究中，结果表明内源性雌激素对乳腺癌的发展起到了关键作用[2]。Key 等[3]汇总分析了9 项雌激素物质对663 名女性中未接触过外源性雌激素情况下患有乳腺癌的女性的影响，结果表明随着雌激素水平的上升，患乳腺癌的风险明显增加。Fuhrman 等[4]分别研究了15 种雌激素和雌激素代谢物的循环水平与代谢途径对乳腺癌风险的相关性，研究显示患乳腺癌的风险与雌二醇水平呈正相关。大量数据表明雌激素会也增大男性患前列腺癌的几率。Qin 等[5]调查了不同地区牛奶中雌激素的含量和居民牛奶摄入量及该地区男性患前列腺癌的人数，数据显示西方以雌激素含量较高的牛奶、乳制品为主食的地区造成了其男性更高的前列腺癌发生率。Kosti 等[6]研究了尿液中的雌激素和雌激素代谢物对引起前列腺癌的影响，发现在所有的雌激素代谢物浓度中，前列腺癌患者的儿茶酚雌激素浓度高于健康男性。Carlo 等[7]评估了男性视网膜上皮细胞中性类固醇激素波动，结果表明性类固醇波动是视网膜环境变化的诱导因素，能引起眼睛老化等生理问题。

目前在工业生产中，雌激素因对糖类、脂质、蛋白质等营养物质的合成起到重要作用而广泛应用于动物饲料、食品、化妆品中，功能发挥后多余的雌激素往往会通过食物链直接或间接进入到人体，直接伤害人类健康[8]，并且一些公司为了节省商品制作成本，直接选择忽略饲料及食品中的雌激素含量，造成了频繁的雌激素污染事件。此外，在粮食中污染最严重的霉菌毒素之一——玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）作为雌激素的结构类似物具有雌激素样作用，能造成动物急慢性中毒，引起繁殖机能异常甚至死亡，给畜牧场造成巨大经济损失并危害食用人群的健康。针对当下现状，雌激素检测手段的重要性不言而喻，本文总结了一些针对液态环境常用的雌激素检测方法，重点介绍近几年发展的转基因生物反应器在雌激素检测方面的应用。

1 转基因生物（genetically modified organism，GMO）反应器

转基因生物反应器是利用微生物细胞通过基因工程技术手段将外源基因转化到受体中进行高效表达，从而获得具有重要应用价值的表达产物的生命系统。目前关于该方法的研究中使用的表达载体主要为酵母细胞，使用的外源基因主要是β-半乳糖苷酶（LacZ 基因）、绿色荧光蛋白（yEGFP 基因）和荧光素酶（Luc 基因）等。

Black 等[9]基于LacZ 基因构建了酵母雌激素筛选系统，如图1所示。

图1 双质粒重组酵母系统Fig.1 Double plasmid recombinant yeast system

该系统将人体雌激素受体（human estrogen receptor，hERα）和携带雌激素反应元件（estrogen response element，ERE）的表达质粒一起整合到酿酒酵母细胞中，其中ERE 控制报告基因β-半乳糖苷酶的表达，在检测环境含有雌激素活性的化学物质的情况下，酵母细胞分泌的β-半乳糖苷酶分解培养基中的显色底物氯酚红β-D-吡喃半乳糖苷（chlorophenol red β-D-galactopyranoside，CPRG），黄色底物分解为红色产物，其浓度可通过分光光度法进行测量。

Rikke Brix 等[10]评估了该重组酵母系统作为环境样品的预筛选工具的适用性，将样品连续稀释后加入含有显色底物和重组酵母细胞的培养基中，结果显示样品中的17β-雌二醇的检测水平为0.681 ng/mL，检测限为 0.084 ng/mL～0.73 ng/mL。Vieira Dias 等[11]使用该重组酵母检测系统评估了巴西里约热内卢天然水域和官渡河水样中的雌激素活性物质，结果显示在里约热内卢河流的三个采样地点采集的水样的17β-雌二醇等价值（17β-estradiol equivalents，EEQ）最大浓度为16 ng/L，官渡河采集样品中最大EEQ 值为15 ng/L。Beck 等[12]使用该重组酵母系统检测了德国波罗的海沿海地区地表水的总雌激素活性物质含量，检测结果显示Inner Wismar Bay，Eggers Wiek 和达尔斯半岛地区的 EEQ 值范围分别为 0.06 ng/L～0.34 ng/L、0.03 ng/L～0.41 ng/L 和 0.17 ng/L～0.28 ng/L。

Hairong Xu 等[13]基于绿色荧光蛋白（yEGFP 基因）构建了一株可以快速筛选和监测环境中雌激素化学物质的重组酵母细胞，该菌株先后插入两个质粒，包括一个含有与GPD 基因启动子融合的人雌激素受体（hER）cDNA 质粒和另一个由 ERE 控制下插入yEGFP 基因（绿色荧光蛋白）的质粒，检测样品中雌激素活性化学物质的浓度可通过表达的绿色荧光蛋白的量来进行判定。Sylwia 等[14]根据此重组酵母表达系统检测了从波兰农村Leczna 和卢布林省工业区ZAPulawySA 的12 个农场收集的奶牛产奶样品的雌激素含量，检测结果显示农村和工业区的牛奶样品中检测到含有雌激素活性的样品分别占有43%、57%，其中农村地区样品的雌激素EEQ 值范围为0.30 ng/L～0.44 ng/L，工业地区样品的雌激素EEQ 值为0.29 ng/L～0.49 ng/L。

Salste L 等[15]通过化学分析和基于荧光素酶（Luc基因）构建的重组酵母表达系统测定了从市政污水处理厂收集的废水样品中的17β-雌二醇、雌酮、雌三醇和17α-炔雌醇等雌激素和雌激素活性物质的含量，结果显示雌激素的平均水平值为4 ng/L～7 ng/L。除了酵母表达系统，也有研究者基于其他的表达载体构建了雌激素检测反应器。Christoph Zutz 等[16]通过基因工程技术构建了一株含有人类雌激素受体α 和β-半乳糖苷酶基因的修饰菌株构巣曲霉Aspergillus nidulans，使用血液、尿液、唾液和牛奶样品对该真菌生物反应器的雌激素反应进行验证，并将结果与酶联反应法检测结果进行比较，检测结果基本显示出一致性，此外，该生物反应器检测样品不需要提前进行预处理即可直接检测，对于17β-雌二醇等雌激素检测限低至1 ng/L。Thomas Hahn 等[17]通过基因工程构建了在Arxula adeninivorans 衍生的葡糖淀粉酶（glucoamylase，GAA）启动子控制下表达人体雌激素受体（h ERα）和由雌激素感应元件（estrogen response element，ERE）控制表达克雷伯氏菌植酸酶（klebsiella phytase，PHYK）报告基因的重组Arxula adeninivorans 表达系统，在雌激素化合物的存在下表达系统诱导表达植酸酶，研究者探索了不同的启动子位置插入不同数量的雌激素感应元件对报告基因表达的影响，在所有的重组细胞中，雌激素活性的检测限先后达到了10 ng/L 和5 ng/L。

生物反应器检测法是20 世纪90 年代才发展起来的雌激素研究方法，该方法除了前期构建表达系统需要一定的技术基础，在检测阶段不仅费时少、灵敏度高、特异性强，在试验操作和成本上也具有极大的优势。

2 高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）

高效液相色谱方法是20 世纪80 年代至90 年代发展的一门科学检测技术，因其灵敏度高、检测时间短、可同时进行定性和定量检测而得到快速广泛的应用，包括在科学研究中各种化学物质的研究与检测。在雌激素活性物质检测方面，高效液相色谱主要应用于牛奶、农产品等样品的检测。Yan 等[18]使用固相萃取-高效液相色谱技术，快速测定了从中国新乡随机采集的3 种不同品牌的牛奶样品中的雌酮、雌二醇和雌三醇含量，这三种雌激素物质在牛奶样品中的平均覆盖率分别为92.6%、90.9%、104.1%，在牛奶样品中的平均含量分别为 0.275、0.247、0.371 μg/mL，该液相检测条件对3 种雌激素物质的检测限分别为0.028、0.025、0.045 μg/mL。丁郭影等[19]以 HPLC 技术为基础，结合微波辅助提取法，建立了牛奶中雌激素检测的方法，在最佳的液相色谱条件及微波工艺条件下，研究结果得到雌二醇、雌三醇、雌酮的检测限分别为：145、1.68、1.72 μg/mL。刘敏等[20]以家禽猪粪中较为常见具有潜在危害的17α-雌二醇、17β-雌二醇、雌三醇和雌酮作为研究对象，建立了分析这4 种类固醇雌激素的GC-MS 检测方法，检测结果表明，在优化的检测条件下，这四种雌激素的检测限分别为 8.0、2.5、5.1、3.3 μg/kg，平均加标回收率在92.3%～137.4%之间。Xiuqin Wang等[21]使用高效液相色谱结合管内固相微萃取技术建立了一种简便灵敏的检测方法，分析了5 种雌激素标准样品，具有良好的重复性，标准偏差＜4.1%，检出限为0.05 mg/L～0.30 mg/L。Guihua Gao 等[22]基于几种金属-有机骨架混合基质膜的漩涡辅助膜萃取方法提取人体尿液中的4 种雌激素-雌酮、17β-雌二醇、雌三醇和炔雌醇，使用高效液相色谱技术荧光检测进行分析，结果表明提取的雌激素检测范围为0.02 ng/mL～200 ng/mL，检出限为0.05 ng/mL～1.0 ng/mL。虽然高效液相色谱具有很好的灵敏度和特异性，也广泛应用于各个高校实验室和研究所检测，但存在仪器本身成本高、不易移动、检测地点受局限等短板，这些都是无法解决也难以得到改善的因素。

3 气相色谱法（gas chromatography，GC）

气相色谱法是所有雌激素活性物质检测方法中最早发展应用的方法，因其高效能、高灵敏度、强选择性、极快的分析速度、操作简便等优点，在20 世纪60年代至80 年代间，研究者们对各类样品中雌激素活性物质的检测主要就是通过气相色谱法。目前，气相色谱法在雌激素物质检测方面主要是应用于自然界河流、工业区废水样品的检测。Basheer 等[23]使用聚合物涂层空心纤维微量提取技术结合气相色谱法检测水库及饮用水样品中的雌激素含量，通过逐渐降低样品中分析物浓度得出该检测系统的检测限范围为0.03 ng/L～0.8 ng/L。Zhou 等[24]采用柱前三甲基甲硅烷基衍生化和气相色谱结合方法检测了地表水和废水处理厂流出的处理水样品中的雌激素含量，在优化的检测条件下，与超纯水空白相比，色谱中没有明显干扰出现，样品中 DES、E1、E2、EE2、E3、Ev 的检出限分别为 0.01、0.03、0.03、0.07、0.09、0.13 ng/mL。廖涛等[25]使用固相萃取-气相色谱/质谱联用法建立了有效检测残留雌激素的方法，对水中的雌酮、雌二醇、雌三醇、双酚A、炔雌醇等9 种雌激素进行了同时检测，初步分析了荆州市四湖总干渠受环境雌激素污染的3 个不同断面的污染程度。Rocha 等[26]使用气相色谱法分析了分别在4 个季节中从塔古斯河9 个地点中采集的水样，评估了包括天然、工业、制药、家庭污染物、植物甾醇等在内的17 种雌激素类似物，并从其中的两个采样地点中发现了来自工业和家庭污染的雌激素物质。近年来随着高效液相和其他检测方法的发展，气相色谱检测的应用逐渐减少，且其不足之处类似于高效液相色谱法，只能在室内进行样品的检测。

4 拉曼光谱法（Raman spectroscopy，RS）

拉曼光谱检测技术[27]是利用拉曼光谱来研究分子振动、转动的一种光谱学方法，其发展应用相比气相色谱法和高效液相色谱起步更晚，在雌激素检测方面的研究也是近十年才开始探索。因拉曼光谱主要功能为定性检测，故在雌激素的检测方面更多集中于样品中多种雌激素物质的定性检测。冯超等[28]应用RM-200型便携式拉曼光谱仪对17β-雌二醇、雌三醇和乙烯雌酚等3 种激素类药品进行拉曼光谱检测分析，并对3种雌激素进行了分析对比和模拟计算。结果表明拉曼技术可以快速准确的定性检测出这3 种雌激素，乙烯雌酚在 724、822、908、1 141、1 254、1 554、1 925 cm-1处存在特征峰；雌三醇在 831、1 045、1 111、1 278、1 417 cm-1处存在特征峰；17β-雌二醇 在 865、1 031、1 075、1 257、1 432 cm-1处存在特征峰，上述峰可作为拉曼光谱检测3 种激素的依据。Yang Liu 等[29]建立了一种简单、快速的表面增强共振拉曼散射（surface enhanced Resonance raman scattering，SERRS）的痕量酚类雌激素检测方法，通过偶联反应，偶氮化合物形成强烈的SERRS 活性，建立了雌酮、雌三醇、双酚A 的定性检测方法，因偶氮染料的每一个印记只会对特定的雌激素进行染色，故具有极高的特异性，适用于通过偶联反应进行检测的酚类雌激素。拉曼光谱法目前应用相比上述检测方法并不广泛，主要原因在于其在定量检测方面的不足，拉曼光谱的定性检测对商业食品中雌激素含量的定量检测毫无应用之处，这在目前对食品安全的日益重视的大趋势下是一个极大的不足。

5 其他检测方法

5.1 化学发光法（chemiluminescence，CL）

化学发光分析法[30]是分子发光光谱分析法中的一类，因其操作简便、具有较好的灵敏度而被应用于食品药品分析、环境检测等领域。谢良枭等[31]采用KMnO4-邻菲咯啉钌-Na2SO3化学发光体系来测定雌激素含量，检测结果表明其检出限为3.8×10-7mg/mL，并使用该方法成功应用于实际样品中雌激素的检测。

5.2 电化学生物传感器（electrochemical biosensor，EB）

生物传感器技术是分析生物科学的一个分支，其中电化学生物传感器是最早出现的生物传感器，该方法利用了生物反应的特异性，同时具有电化学分析方法的高灵敏度，从而可以实现对生物大分子之间相互作用的实时检测。Beitollahi H 等[32]应用一种以磁性分子印迹纳米粒作为表面活性剂来改良电极的电化学传感器检测雌激素双酚A，结果表明其对双酚A 的检测灵敏度是未经过改良的传感器的2.6 倍，且该方法已证实应用于样品的大量检测。Zhu L 等[33]也使用该方法对饮用水和湖水中的雌激素进行了检测，检测范围为6.0×10-7mol/L～1.0×10-4mol/L，检出限为 1.0×10-7mol/L。

5.3 分子印迹技术（molecular Imprinting Technology，MIT）

分子印记技术[34]将模板分子与功能单体相结合，在交联剂的作用下共聚得到固体介质，通过物理或化学方法将模板分子洗脱，获得具有与目标分子空间构型和功能基团排列相匹配的结合位点的分子印迹聚合物。张淑琼等[35]采用氧化铝模板法和溶胶凝胶法，以雌酮作为印迹分子，合成了对雌酮有特异性识别的SiO2纳米管膜，研究结果表明纳米管对目标分子具有高选择性、高亲和性、高容量和快速结合能力。马金余等[36]以己烯雌酚为模板分子，α-甲基丙烯酸为功能单体，二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂，合成己烯雌酚分子印迹聚合物，通过选择不同浓度的甲醇水溶液，己烯雌酚达到理想的分离纯化效果；对加标鸡肉样进行了含量测定，回收率可达95%以上。

5.4 酶联免疫法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）

酶联免疫法主要是根据抗原抗体的特异性结合对样品中的雌激素物质进行检测，在灵敏度检测方面不够高，但因具有较强的特异性，检测时间短，故在样品的定性检测方面具有广泛的应用。Wang 等[37]研究开发了针对雌（E-1）、17β-雌二醇（17β-E-2）和雌三醇（E-3）的高特异性、高灵敏性单克隆抗体，根据竞争性酶联免疫吸附剂，抗 E-1、抗 17β-E-2 和抗 E-3 单克隆抗体的半数最大抑制浓度值分别为0.46、0.36、0.39 ng/mL。

6 结论与展望

目前已有大量文献研究表明雌激素对女性生理现象混乱、男性生殖系统异常、动物繁殖能力及对机体神经系统、消化系统、呼吸系统、心血管系统和骨骼系统的常见疾病都有一定程度的影响，因此，建立更灵敏、更高效、更完整的雌激素检测体系刻不容缓。当前关于雌激素的检测研究主要集中在雌酮、雌二醇、雌三醇和炔雌醇等几种物质，研究范围相对狭隘，此外，除了已经发现但还未付诸检测研究的雌激素活性物质，还有大量尚未被发现的带有雌激素毒性的物质，需要我们进行进一步地探索发现，这对人类的生存环境和减少身体疾病具有重要意义。

在雌激素检测方法研究方面，相对成熟的方法主要是气相色谱和高效液相色谱法，笔者在探索霉菌毒素玉米赤霉烯酮的生物降解机理过程中，主要使用高效液相色谱法检测ZEA 的含量，虽然检测灵敏度和重现性均良好，但不适用现场、快速的检测，尤其仪器维护成本较高[38-44]。本文详细介绍的转基因生物反应器在定性和定量检测以及研究成本、生态环境方面都具有的明显的优势，但目前国内外关于该方法的建立研究屈指可数，且其表达载体主要为酵母，在日后的研究中，可以在目的基因、受体和载体当面作更为深入的研究，使转基因生物反应器检测方法发展为更成熟的检测体系。