微波预处理-超声波辅助提取紫山药多糖及抑制α-葡萄糖苷酶活性研究

王彦平，陈月英，贾彦杰，曹娅，宿时，娄芳慧

（河南农业职业学院食品工程学院，河南 郑州 451450）

紫山药多糖是紫山药细胞壁的结构成分，具有抗氧化[1]、免疫调节[2]、抗衰老[3-4]、降糖[5]、耐缺氧[6]等多种生物活性。目前研究紫山药多糖的提取方法主要集中在热水浸提法[7]、超声波提取法[8]、微波提取法[9]和生物酶法提取[10]等，其中热水浸提法耗时长、温度高、得率低、纯度低，超声波法提取时间短、得率高，但长时间作用会破坏多糖活性[11]，微波法虽提取时间大为减少，但提取温度难以控制，亦会破坏多糖活性。微波预处理-超声波辅助提取法首先采用微波对经水浸润的物料粉进行0.5 min～3 min 微波预处理，利用微波的热效应使生物细胞壁和细胞膜迅速破裂，然后进行20 min～60 min 超声波提取，利用超声波空化作用、机械作用和热效应进一步破坏生物细胞壁结构，加快多糖释放速度[12]。因此微波预处理-超声波辅助提取法结合微波提取法和超声波提取法的优点，既能快速提取物料中的功能成分，也能避免微波或超声波作用时间过长使多糖活性遭到破坏，是一种极具开发价值的提取技术，目前微波-超声波辅助提取紫山药多糖的方法尚未见报道。

目前糖尿病已经成为严重威胁人类健康的疾病之一。Ⅱ型糖尿病的主要症状之一是餐后高血糖，α-葡萄糖苷酶抑制剂作为临床上常用的口服降糖药物能够抑制小肠内蔗糖、麦芽糖的水解从而降低餐后血糖[13]。而合成的α-葡萄糖苷酶抑制剂具有一定的毒副作用，因此从植物中筛选安全有效的天然α-葡萄糖苷酶抑制剂成为当下研究的热点方向。

本文采用微波预处理-超声波辅助提取紫山药多糖，对其提取工艺进行优化，并采用Sevag 法脱蛋白和醇沉后得紫山药粗多糖，并对紫山药多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制能力进行研究，旨在为我国紫山药活性物质的综合利用和规模化生产提供技术支撑和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

紫山药：产自广西南宁。洗净、沥干、去皮、切片，于60 ℃烘干24 h，料理机粉碎后过50 目筛。干燥器中保存，备用。

阿卡波糖：合肥博美生物科技有限责任公司；4-硝基苯-α-D-吡楠葡萄糖苷（pNPG）：Sigma-Aldrich 公司；α-葡萄糖苷酶（50 U/mg）：上海源叶生物科技有限公司；乙醚、三氯甲烷、正丁醇、苯酚、浓硫酸、无水乙醇、葡萄糖、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、碳酸钠等均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器

UV1901PCS 双光束紫外可见光分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司；BS224S 分析天平：德国赛多利斯公司；HH-2 数显恒温水浴锅：上海乔跃电子科技有限公司；D5-R2 离心机：湖南湘仪离心机仪器有限公司；RE2000 旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；202-3AB 电热恒温鼓风干燥箱：上海乔跃电子科技有限公司；SCIENTZ-ⅡDM 微波光波超声波萃取仪：宁波新芝有限公司。

1.3 溶液配制

磷酸盐缓冲溶液（phosphatebufferedsolution，PBS）：称取 7.80 g 磷酸二氢钾（NaH2PO4·2H2O）和 17.90 g磷酸氢二钾（Na2HPO4·2H2O），分别用蒸馏水溶解定容至250 mL，配制成0.2 mol/L 的母液，再按 NaH2PO4∶Na2HPO4=51∶49 的体积比配制成 pH6.8 的 0.2 mol/L的PBS 溶液。

α-葡萄糖苷酶溶液：取1 mg α-葡萄糖苷酶粉末，用pH 6.8 的PBS 溶液溶解定容至50 mL，配制成浓度为1 U/mL 的α-葡萄糖苷酶溶液。

4-硝基苯-Β-D-吡喃葡萄糖苷（4-Nitrophenyl-β-D- glucopyranoside，pNPG）溶液：称取 30.13 mg pNPG粉末，用pH 6.8 的PBS 溶液溶解定容至100 mL，配制成浓度为10 mmol/L 的pNPG 溶液。

碳酸钠溶液：称取1.06 g 碳酸钠粉末，用蒸馏水溶解定容至100 mL，配制成0.1 mol/L 的Na2CO3溶液。

阿卡波糖溶液：用pH 6.8 的PBS 溶液配制成不同浓度的阿卡波糖溶液。

紫山药粗多糖溶液：将最佳工艺条件获得的紫山药粗多糖粉末，用pH 6.8 的PBS 溶液配制成不同浓度的多糖溶液。

1.4 试验方法

1.4.1 葡萄糖标准曲线的绘制

采用苯酚-硫酸法[14]，精密称取一定量105 ℃烘干至恒重的葡萄糖，分别制得浓度为0、6.0、18.0、30.0、42.0、54.0 μg/mL 葡萄糖标准溶液，精确移取 2.0 mL 葡萄糖标准溶液至10 mL 容量瓶中，依次加入0.7 mL6%苯酚溶液和5.0 mL 浓硫酸，置沸水浴中显色20 min，取出后至冷水中冷却10 min，冷却后去除静置10 min，在488 nm 处测定其吸光度。以葡萄糖浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.4.2 紫山药粉预处理

将紫山药粉用乙醚90 ℃回流脱脂2 h，乙醚挥发完全后，置于恒温箱60 ℃干燥至恒重。

1.4.3 多糖的提取工艺流程

预处理紫山药粉与水按一定料液比混合，采用微波预处理后，在60 ℃下进行超声波提取，将提取液离心（4 000 r/min，15 min）后取上清液。将上清液置于250 mL 具塞三角瓶中，按4∶1（体积比）比例加入Sevag（V三氯甲烷∶V正丁醇=4∶1）试剂[15]，摇床震荡 30 min，置分液漏斗中静置分层，弃下层胶状变性蛋白质层，取上面水层离心（8 000 r/min，10 min）后取上清液，重复操作3 次。用旋转蒸发仪低温减压将上述上清液浓缩后，加入无水乙醇至终浓度为75%，静置醇沉18 h[16]，离心（4 000 r/min，10 min）后弃上清液，收集得到粗多糖。

多糖得率/%=多糖质量（g）/紫山药粉质量（g）×100

1.4.4 紫山药粗多糖粉末中多糖质量分数测定

紫山药粗多糖粉末在恒温箱60 ℃下干燥至恒重，精确称取紫山药多糖粉末20 mg，用水定容至250 mL做多糖储备液。取多糖储备液2.0 mL，按照1.4.1 中操作测吸光度。

多糖质量分数/%=多糖质量（g）/紫山药多糖粉末质量（g）×100

1.4.5 单因素试验

微波预处理-超声提取紫山药多糖混合液，4 000 r/min 离心15 min 后取上清液得多糖粗提液，经Sevag 法脱蛋白3 次后提取液，按照1.4.1 的方法测定粗提液的吸光度，并计算粗多糖得率。

1.4.5.1 料液比对粗多糖得率的影响

固定条件为微波功率300 W、微波时间30 s、超声功率180 W、超声时间20 min，设计料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）加入蒸馏水，考察不同料液比对粗多糖得率的影响。

1.4.5.2 微波功率对粗多糖得率的影响

固定条件为料液比 1∶30（g/mL）、微波时间 30 s、超声功率180 W、超声时间20 min，设计微波功率分别为 150、300、450、600、750 W 时预处理，考察微波功率对粗多糖得率的影响。

1.4.5.3 微波时间对粗多糖得率的影响

固定条件为料液比 1∶30（g/mL）、微波功率 300 W、超声功率180 W、超声时间20 min，设计微波时间分别为 10、20、30、40、50 s 预处理，考察微波时间对粗多糖得率的影响。

1.4.5.4 超声功率对粗多糖得率的影响

固定条件为料液比 1∶30（g/mL）、微波功率 300 W、微波时间30 s、超声时间20 min，设计超声波提取功率分别为 90、180、270、360、450 W，考察超声功率对粗多糖得率的影响。

1.4.5.5 超声时间对粗多糖得率的影响

固定条件为料液比 1∶30（g/mL）、微波功率 300 W、微波时间30 s、超声功率180 W，设计超声波提取时间分别为 10、20、30、40、50 min，考察超声时间对粗多糖得率的影响。

1.4.6 正交试验

在单因素试验基础上，设计出四因素三水平L9（34）的正交试验，见表1。

表1 正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

微波预处理-超声波辅助提取紫山药多糖混合液，离心后取上清液，经Sevag 法脱蛋白3 次后提取液，按照1.4.1 方法测定粗提液的吸光度，并计算紫山药粗多糖得率，以确定微波预处理-超声波辅助法提取紫山药多糖的最佳工艺条件。

1.4.7 紫山药多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

参考文献[17]测定方法，用移液枪移取不同浓度的阿卡波糖溶液和紫山药多糖溶液各40 μL 于酶标板中，再向各孔中加入40 μL α-葡萄糖苷酶溶液，混匀后 37 ℃反应 10 min，取出后加入 30 μL pNPG 溶液，混匀后37 ℃反应30 min，取出后加入90 μL 碳酸钠溶液，终止反应。用酶标仪测定405 nm 处吸光值A，同时设立空白组和背景组，计算抑制率。

抑制率/%=[A空白-（A样品-A背景）]/A空白×100

式中：A空白为 PBS（40 μL）+α-葡萄糖苷酶（40 μL）+pNPG（30 μL）+碳酸钠（90 μL）条件下测得的吸光值；A样品为多糖溶液（40 μL）+ α-葡萄糖苷酶（40 μL）+pNPG（30 μL）+碳酸钠（90 μL）条件下测得的吸光值；A背景为多糖溶液（40 μL）+PBS（40 μL）+pNPG（30 μL）+碳酸钠（90 μL）条件下测得的吸光值。

1.5 数据处理

采用excel 2007 进行试验数据处理及图表制作。

2 结果与分析

2.1 紫山药标准曲线

按照“1.4.1”进行操作，结果显示葡萄糖标准溶液浓度与吸光度的线性回归方程为：Y=0.016 4x+0.013 8，R2=0.999，表明在 0～54 μg/mL 范围内葡萄糖的浓度与吸光度呈良好的线性关系。葡萄糖标准曲线见图1。

2.2 紫山药多糖提取的单因素试验

2.2.1 料液比对粗多糖得率的影响

料液比对粗多糖得率的影响见图2。

由图2可知，当料液比由 1∶10（g/mL）降低到1∶40（g/mL）时，紫山药粗多糖得率快速升高，在料液比为 1∶40（g/mL）达到最大值，说明一定范围内，料液比越小即水越多，越有利于多糖的溶出；但当水过多时可能会影响超声波的空化效应和机械振动的效果，多糖得率反而下降[18]。故选择料液比为1∶40（g/mL）较为适宜。

2.2.2 微波功率对紫山药粗多糖得率的影响

微波功率对紫山药粗多糖得率的影响见图3。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

图2 料液比对粗多糖得率的影响Fig.2 Effect of water-material ratio on polysaccharide yield

图3 微波功率对粗多糖得率的影响Fig.3 Effect of microwave power on polysaccharide yield

由图3可知，随着微波功率的提高，紫山药粗多糖得率缓缓上升，当微波功率达到450 W 后，粗多糖得率趋于平稳。可能是由于微波可使紫山药细胞壁遭到破坏，有利于多糖溶出，随着微波功率的增大，温度升高，部分多糖发生水解[19]。微波功率达到450 W 后，粗多糖得率趋于平稳，考虑能源消耗，选择微波功率150、300、450 W3 个水平进行优化试验。

2.2.3 微波时间对粗多糖得率的影响

微波时间对粗多糖得率的影响见图4。

图4 微波时间对粗多糖得率的影响Fig.4 Effect of microwave time on polysaccharide yield

由图4可知，随着微波预处理时间的延长，紫山药粗多糖得率呈现向上升后下降的趋势，微波预处理时间达到30 s 时得率最高。可能是由于在一定的范围内，随着微波时间的延长，紫山药细胞破裂，多糖溶出增多，但过长的微波预处理时间可能会使部分多糖水解。微波预处理时间达到30 s 时得率最高，选择微波预处理时间20、30、40 s 3 个水平进行优化试验。

2.2.4 超声功率对粗多糖得率的影响

超声功率对粗多糖得率的影响见图5。

图5 超声功率对粗多糖得率的影响Fig.5 Effect of ultrasonic power on polysaccharide yield

由图5可知，当超声功率低于270 W 时，随着超声功率的增加，紫山药粗多糖得率逐渐升高，但超声功率超过270 W 后，粗多糖得率反而下降，可能由于超声波具有较强的剪切作用，功率过高会导致多糖化学键断裂，进而影响紫山药粗多糖得率[20]。超声功率为270 W 时，紫山药得率最高，选择超声波提取功率为180、270、360 W 3 个水平进行优化试验。

2.2.5 超声时间对粗多糖得率的影响

超声时间对粗多糖得率的影响见图6。

由图6可知，超声波提取时间低于40 min 时，随着提取时间的延长，紫山药粗多糖得率逐渐升高，当达到40 min 后紫山药粗多糖得率趋于平稳，可能由于此时细胞壁的破坏趋于完全[20]。超声时间为50 min 时，紫山药的得率最高，考虑到能源消耗，选择超声波提取时间为30、40、50 min3 个水平进行正交试验。

图6 超声时间对粗多糖得率的影响Fig.6 Effect of ultrasonic time on polysaccharide yield

2.3 紫山药多糖提取的正交试验

紫山药多糖提取的正交试验结果见表2。

表2 紫山药粗多糖提取的正交试验结果Table 2 The results of orthogonal test of extraction of purple yam diosgenin

正交试验结果分析表明，紫山药粗多糖微波预处理-超声波提取方法中各因素重要性的顺序为B＞A＞D＞C，即微波时间＞微波功率＞超声时间＞超声功率。最佳提取工艺为A2B2C2D1，即微波功率300 W、微波时间30 s、超声功率270 W、超声时间30 min。按最佳工艺条件提取紫山药多糖，平行3 次，紫山药粗多糖的平均得率为（11.12±1.06）%，高于正交试验中的最大值。醇沉后的紫山药多糖粉末的多糖质量分数为45.80%。

2.4 紫山药多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

紫山药多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用见图7。

由图7可知，随着阿卡波糖浓度的增加，对α-葡萄糖苷酶的抑制率明显增强；紫山药粗多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率与质量浓度之间也呈良好的对数关系。阿卡波糖的曲线方程为：Y=12.323ln（x）+119.89（R2=0.993 4），IC50=0.003 4（mg/mL）。紫山药多糖的曲线方差为：Y=11.725ln（x）+82.797（R2=0.985 5），IC50=0.061 0（mg/mL）。结果显示紫山药粗多糖对α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用，相同质量浓度下，紫山药多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用较阿卡波糖弱（p＜0.01）。

图7 紫山药多糖溶液浓度对α-葡萄糖苷酶活性的影响Fig.7 Effect of purple yam polysaccharide solution concentration on α-glucosinase activity

3 讨论

本研究用微波预处理-超声波辅助提取法从紫山药中提取多糖，其最优化工艺条件为为料液比1∶40（g/mL）、微波功率300 W、微波时间30 s、超声功率270 W、超声时间30 min。在最佳工艺条件下，紫山药多糖平均得率为（11.12±1.06）%，多糖得率高于超声提取法[8]。该工艺方法可缩短提取时间、提高多糖得率、节省提取剂、降低生产成本、多糖活性良好。

阿卡波糖或米格列醇的类似物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用已经被应用在临床，用于糖尿病的治疗，可有效抑制小肠内蔗糖、麦芽糖等水解为葡萄糖，从而降低餐后血糖。目前已从多种常见植物中分离制备出多糖用于抑制α-葡萄糖苷酶的研究[21]。宋曙辉等[5]动物实验结果表明，紫山药具有降低大鼠血糖的作用。杭悦宇[2]药理试验结果表明，包括紫山药在内的多种山药水提液具有明显的降血糖作用。本研究通过α-葡萄糖苷酶活性体外抑制试验发现，在相同质量浓度下，紫山药多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制能力较阿卡波糖弱，但也表现出明显的抑制活性。紫山药多糖在试验浓度下，浓度与α-葡萄糖苷酶清除率呈现良好的量效关系，即浓度越高抑制能力越强。综上所述，紫山药多糖具有一定的体外降糖活性，其体内外降糖活性及机理还有待进一步研究。