基于炮姜有效成分筛选炮姜炮制辅料河砂粒径及其炮制工艺研究

黎代余，冯 图，汪青筑，查 钦，刘洪明，徐莲，刁家文

(1.毕节职业技术学院，贵州 毕节 551700；2.贵州工程应用技术学院 生态工程学院，贵州 毕节 551700；3.毕节市中药研究所，贵州 毕节 551700)

炮姜是姜科植物姜(ZingiberofficinaleRosc.)的干燥根茎经砂烫而成的炮制品，具有温中散寒、温经止血的功效，临床用于治疗中气虚寒引起的腹痛、腹泻及虚寒性出血症[1]。现代研究表明，炮姜中的主要成分为姜酚(gingerol)，其中含量较高的为6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚等。2015版《中国药典》一部以6-姜酚为炮姜的质量控制指标，并规定其含量不低于0.30%。有关炮姜研究的文献较多，主要集中在炮姜经炮制后化学成分的变化及炮制工艺上[2-3]，但在提到炮姜炮制辅料河砂时，均参照《中国药典》所述之河砂或细砂，河砂粒径大小并没有明确的说明，关于使用何种粒径河沙的研究也未见报道。本文以不同粒径河砂为研究对象，分析比较在相同的炮制时间、炮制温度、料药比下炮制的炮姜中6-姜酚、8-姜酚、10姜酚以及总姜酚的含量差异，优选出适合炮姜炮制的河砂，并对其炮制工艺进行研究，以期为规范炮姜炮制提供参考依据。

1 材料

1.1 仪器

UltiMate 3000XRS型高效液相色谱仪，配有UltiMate 3000四元梯度泵、DAD二极管阵列检测器、Chromeleon工作站、U3000 TCC-3000SD标准柱温箱(美国赛默飞公司)；ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，美国安捷伦公司)；OHAUS CORPORATION电子分析天平(十万分之一，美国OHAUS公司)；超声机(上海冠特超声仪器有限公司)；家用煤气炉(福州万宝电器有限公司)；泰克曼高温测温仪TD1100(泰克曼(南京)电子有限公司)；标准粒度筛(浙江上虞市道墟张兴砂筛厂)；铁锅(生铁铸，购于一般菜市场)。

1.2 试药

干姜药材购于荷花池药材市场，经试验组成员贵州工程应用技术学院冯图教授鉴定为姜科植物姜(ZingiberofficinaleRosc．)的干燥根茎。对照品6-姜酚(批号：MUST 1712 0205)、对照品8-姜酚(批号：MUST 1832 804)、对照品10-姜酚(批号：MUST 1833 004)，均购自成都曼斯特生物科技有限公司；乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)，甲醇(分析纯，天津市富宇精化工有限公司)，水为蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 姜酚含量测定

2.1.1 河砂制备 将取自河滩的河砂先用12 mm孔径的筛子筛去粗大砂粒，然后用不同规格的筛子筛选出1 mm、3 mm、5 mm、7 mm和9 mm粒径的砂子，用自来水冲洗至见清水，将砂子沥干后置于铁锅内加热翻炒除去水分，备用。混合砂为1 mm、3 mm、5 mm、7 mm和9 mm粒径的河砂等质量混合而成。

2.1.2 炮姜炮制品及干姜药材制备[4]按照《中国药典》2015版第四部(通则0213)项下烫法要求，称取“2.1.1”项下各规格河砂3 kg置于铁锅内，武火加热，炒至灵活状态，测定离锅底1 cm处的温度，使其保持在(185±3)℃，再加入大小、厚度相近的干姜片0.3 kg，不断翻动，炮制时间7 min，快速出锅，筛去河砂、放凉，粉碎后过60目筛备用。另取干姜药材适量，粉碎过60目筛备用。

2.1.3 对照品储备液制备 精密称取6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚对照品，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得浓度分别为76.5 μg/mL、73.5 μg/mL和55.51 μg/mL的对照品储备液。

2.1.4 混合对照品溶液制备 分别吸取6-姜酚、8-姜酚、10姜酚对照品储备液各5 mL，置于25 mL容量瓶中，摇匀，制得浓度分别为25.5 μg/mL、24.5 μg/mL和18.5 μg/mL的对照品混合溶液。

2.1.5 供试品溶液制备 分别取干姜、各炮姜粉末约0.5 g，精密称定，分别置于250 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，超声(100 W，40 Hz)45 min，放冷，称量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.1.6 色谱条件[5]流动相：乙腈(A)-水(B)，流速：0.6 mL/min，柱温：30 ℃，进样量：10 μL，检测波长：280 nm。梯度洗脱程序为：0→15 min，15%～50%A；15→45 min，50%A；45→60 min，50%～80%A；60→65 min，80%～85%A；65→90 min，85%～90%A；90→100 min，90%A；100→110 min，90%～15%A。

2.1.7 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，分别进样，测定峰面积，以峰面积(Y)为纵坐标，各对照品浓度(X)为横坐标进行线性回归。结果见表1。

方达生和陈清都没有责备我，只是小心翼翼地安抚我，唯恐绊动了我脆弱的神经。他们还感谢我能将孩子还给他们，并承诺再往我的账户里打十万块钱以示感谢。钱？我自嘲地笑了。

表1 6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚标准曲线

2.1.8 精密度实验 精密吸取对照品溶液10 μL，连续进样6次，按照“2.1.6”项下色谱条件进样测定，测得6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚峰面积RSD分别为1.69%、2.52%、1.95%，结果表明仪器精密良好。

2.1.9 稳定性实验 取5 mm河砂炮制的炮姜药材0.5 g，按照“2.1.5”项下操作制备溶液，分别于放置0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h时按照“2.1.6”项下方法测定峰面积，结果6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚峰面积RSD分别为3.11%、2.78%、3.43%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.10 重复性实验 取3 mm河砂炮制的炮姜药材0.5 g 6份，按照“2.1.5”项下方法制备溶液，再按照“2.1.6”项下方法测定峰面积，结果6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚峰面积RSD分别为2.71%、3.33%、3.94%，表明该方法重复性良好。

2.1.11 加样回收率实验 取3 mm河砂炮制的炮姜药材，按照“2.1.5”项下方法制备溶液6份，每份0.25 g，分别加入一定量的6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚对照品溶液，按照“2.1.5”项下方法制备溶液6份，再按照“2.1.6”项下方法测定峰面积，结果6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚的平均回收率分别为101.58%、97.99%、98.21%，RSD分别为2.61%、2.74%、1.90%，结果表明该方法回收率良好。

河砂粒径(mm)6-姜酚含量8-姜酚含量10-姜酚含量总姜酚含量10.314±0.0280.073±0.0130.163±0.0130.550±0.05230.406±0.0140.102±0.0080.227±0.0200.728±0.03250.344±0.0220.089±0.0060.187±0.0100.620±0.02970.367±0.0620.093±0.0140.186±0.0490.646±0.08090.356±0.0180.093±0.0240.189±0.0250.637±0.096混合河砂0.351±0.0260.091±0.0030.167±0.0180.610±0.008干姜0.473±0.0220.095±0.0070.209±0.0040.777±0.024

注：总姜酚含量=(6-姜酚)+(8-姜酚)+(10-姜酚)。

由表2可以看出，3 mm粒径河砂炮制的炮姜中6-姜酚和总姜酚含量最高，分别为0.406%和0.728%；8-姜酚含量在炮姜和干姜样品中没有明显变化；10-姜酚在3 mm粒径河砂炮制的炮姜和干姜样品中的含量相较其他粒径河砂炮制品略有升高。参照《中国药典》2015版一部炮姜项下的规定，3 mm粒径的河砂是炮制炮姜最为合适的辅料。

2.2 炮姜炮制工艺研究

以3 mm河砂为辅料，称取规格大小均匀的干姜药材36份，每份300 g。炮制方法：取10倍量3 mm河砂置于铁锅内，武火加热炒至灵活状态，测定离锅底1.0 cm处温度，使其达到设定为炒制温度时，再加入干姜药材，按照“2.1.2”项下操作炮制。炮姜炮制工艺及结果见表3。

a：6-姜酚；b：8-姜酚；c：10-姜酚

样品温度(℃)时间(min)6-姜酚含量(%)8-姜酚含量(%)10-姜酚含量(%)总姜酚含量(%)S1S2S3S4185±350.411±0.0620.098±0.0170.223±0.0210.741±0.08160.390±0.0830.098±0.0160.221±0.0610.708±0.01770.400±0.0300.096±0.0240.217±0.0370.712±0.08080.367±0.0350.093±0.0060.211±0.0310.671±0.070S5S6S7S8195±350.414±0.0600.106±0.0300.240±0.0580.757±0.01360.401±0.0440.096±0.0210.224±0.0630.715±0.01170.394±0.0610.100±0.0080.221±0.0100.715±0.07480.392±0.0100.100±0.0040.216±0.0190.708±0.015S950.406±0.0200.096±0.0550.213±0.0070.715±0.049S10S11S12205±360.389±0.0370.096±0.0010.203±0.0340.688±0.06270.392±0.0190.099±0.0800.222±0.0350.713±0.01580.397±0.0160.090±0.0420.211±0.0710.698±0.044

从表3结果可以看出，以3 mm河砂为炮制辅料，以195 ℃为炮制温度，炮制时间为5 min时，炮姜中6-姜酚、总姜酚含量最高，8-姜酚和10-姜酚含量与其他炮制温度和炮制时间比较变化不大。因此，以3 mm河砂为炮制辅料，炮制时间5 min，炮制温度195 ℃为炮姜炮制的最佳工艺。

2.3 工艺验证试验

以3 mm河砂为炮制辅料，炮制时间5 min，炮制温度195 ℃炮制炮姜10份，每份300 g，按照“2.2”项下方法炮制炮姜，以炮姜HPLC指纹图谱相似度及SPSS 22.0统计软件分析工艺的稳定性。

2.3.1 HPLC指纹特征图谱测定 取10批炮姜样品，按照“2.1.5”项下方法制备样品溶液，于“2.1.6”项下色谱条件下对10批炮姜药材进行测定，记录图谱，图谱以(.cdf)格式导入 “中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004 A)”生成对照图谱，并进行相似度计算，同时测定6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚及总姜酚的含量。结果见表4、图2、图3。

表4 10批炮姜药材的指纹图谱相似度及其姜酚含量 (%)

图2 指纹对照图谱

图3 10批炮姜指纹图谱

从10批炮姜指纹图谱来看，在本工艺条件下炮制的炮姜的化学成分没有明显变化，每批炮姜HPLC图谱上相应的保留时间上出峰具有一致性。从相似度来看，炮制的10批炮姜相似度均在0.997以上，说明炮制的炮姜相似度较高。

2.3.2 SPSS22.0对炮姜中姜酚测定结果分析 将10批炮姜中变化较大的两种指标成分，即6-姜酚和总姜酚的测定值输入SPSS22.0进行描述统计，获得6-姜酚和总姜酚的正态分布Q-Q图(见图4)。结果10批炮姜中6-姜酚和总姜酚观测值(测定值)在一条直线附近，符合正态分布，表明在此工艺下炮制的炮姜药材具有很好的稳定性。

图4 6-姜酚和总姜酚的正态分布Q-Q图

3 讨论

中药的功效是有效组分综合作用的结果，因此研究炮姜炮制工艺时，本实验以6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚及总姜酚含量为指标进行综合考察，能全面控制炮姜的质量。试验结果表明，以3 mm粒径河砂炮制炮姜最为合适，最终炮制工艺为3 mm河砂，炮制时间5 min，炮制温度195 ℃。验证实验表明本工艺具有极高的稳定性，这一结果对规范炮姜的炮制具有指导意义。

在研究炮制工艺过程中，试验组以4 min为考察时间考察了炮姜的炮制，但并未达到炮姜炮制时表面棕褐色、内部黄色的要求。同时发现，河砂粒径越大，炮姜发胀鼓起越难，要达到炮制感官要求需要更长的时间，且有效成分含量会相应降低，实验组认为这是河砂与干姜接触面积减小导致受热不均、传热不足所致。

有文献报道称，炮姜在炮制过程中，会有新的姜酮产生，但本试验在HPLC分析过程中在姜酮的保留时间内未在炮制品中见到姜酮这一成分，而在5～7.5 min范围，炮姜出现了两个较明显的峰，可能是由于炮姜在炮制时产生极性较大的物质所致。本实验还发现，无论是干姜还是炮姜，其HPLC图谱上保留时间为97 min时均有一化学成分具有很高的含量，韩燕全等[4]在研究炮姜工艺时图谱上也具有这一特征，但对未其成分进行说明，该成分有待进一步研究。