Galectin-3、MMP-9和VEGF在子宫腺肌病组织中的表达及意义*

李灿宇，刘欢欢，党秋红，申爱荣，封全灵

（郑州大学第三附属医院 1.妇科，2.病理科，河南 郑州 450052）

子宫腺肌病是严重危害妇女健康的一种疾病，发病机制尚不明确[1]，血管生成可能是子宫腺肌病发生的重要因素[2]。半乳糖凝集素3（Galectin-3）与多种疾病的发生、发展关系密切，是潜在的诊断标志物和治疗靶点[3]。Galectin-3 在调节血管生成中也发挥重要作用[4]，但其在子宫腺肌病发生中的作用尚不清楚。本研究检测Galectin-3、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase 9,MMP-9）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）在子宫腺肌病在位内膜和异位内膜组织中的表达，分析3 者在异位内膜组织中高表达的相关性，以期为探讨子宫腺肌病新的治疗策略提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年1月—2015年12月郑州大学第三附属医院行手术治疗并经病理证实的子宫腺肌病患者40例作为子宫腺肌病组，年龄34～54 岁，分别取其在位内膜组织和异位内膜组织用于研究，其中分泌期内膜25 例，增殖期内膜15 例。选取同期子宫肌瘤患者40例作为正常对照组，排除子宫腺肌病和子宫内膜异位症患者，取其正常子宫内膜组织用于研究，其中分泌期内膜22 例，增殖期内膜18 例。从上述患者中分别选取20 例子宫腺肌病在位内膜和正常对照子宫内膜组织用于逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）和Western blotting 检测，新鲜组织标本采集后液氮冷冻保存，所用组织标本经10%中性甲醛固定后石蜡包埋保存。研究经本院医学伦理委员会同意，所有标本采集征得患者同意并签署知情同意书。

1.2 序列与试剂

Galectin-3 引物序列参考文献[5]，其他引物同参考文献[6]（Galectin-3，正向引物：5'-GAATGATGTTGCCT TCCAG-3'，反向引物：5'-CACTGGTGAGGTCTATGTCA C-3'；MMP-9，正向引物：5'-TTGACAGCGACAAGAAG TGG-3'，反向引物：5'-TCAGGGCGAGGACCATAGA-3'；VEGF，正向引物：5'-CCCACCCACATACATACAT T-3'，反向引物：5'-CTCCCAACTCAAGTCCACA-3'）。Trizol 试剂、Taq Master Mix（CW0682M）、兔抗人GAPDH 多克隆抗体（CW0101M）购自北京康为世纪生物科技有限公司，逆转录试剂盒（K1622）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，羊抗人MMP-9 多克隆抗体（SC-6840）、鼠抗人Galectin-3 单克隆抗体（TA804697）、鼠抗人VEGF 单克隆抗体（TA803263）、兔抗人单克隆抗体MMP-9（ZA-0562）和兔抗人多克隆抗体VEGF（ZA-0509）购自北京中杉金桥生物科技有限公司。

1.3 RT-PCR 检测

Trizol 法提取总RNA，紫外分光光度计分析纯度，A260/A280 为1.8～2.0。选 择GAPDH为内参，在MMLV RTase 作用下以随机引物进行逆转录。反应体系共50 μl。反应条件为：94℃预变性90 s，94℃变性20 s，57℃退火20 s，72℃延伸1 min，重复30 个循环后72℃再延伸5 min，最后4℃终止反应。RT-PCR 扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳。以目的基因与内参的平均吸光度比值来计算目的基因mRNA 的表达水平。

1.4 Western blotting 检测

取组织各0.2 g 于液氮中砸碎，研磨成粉末状后转移至离心管中，加入蛋白裂解液充分裂解细胞，置于冰上20 min，经超声处理后于4℃、12 000 r/min 离心30 min，收集上清液并用Bradford 法定量。用10% SDS-PAGE 电泳分离，转至PVDF 膜。5%脱脂牛奶封闭后用TBST 缓冲液洗净，分别加入一抗4℃过夜。之后回收一抗，TBST 洗净后加入辣根过氧化物酶（HRP）二抗，1 h 后洗膜，增强型化学发光试剂（ECL）底物显影。以Image-Pro Plus 6.0 扫描计算吸光度值，以目标蛋白与GAPDH 蛋白的比值来表示目的蛋白的相对表达水平。

1.5 免疫组织化学法检测

所有组织标本经石蜡包埋，3 μm 连续切片，用苏木精-伊红（haematoxylin endeosin,HE）染色法观察病理变化，用Envision 免疫组织化学二步法检测蛋白表达情况。实验步骤参照试剂盒说明书进行操作，阳性对照切片由试剂公司提供，染色结果为阳性。阴性对照用PBS 缓冲液代替一抗，染色结果为阴性。

1.6 免疫组织化学结果判定

每张切片选10 个高倍视野（400 倍），根据染色范围及染色强度来计算评分。按阳性细胞所占百分比评分：无阳性细胞者为0 分，1%～25%为1 分，26%～50% 为2 分，51%～75% 为3 分，76%～100%为4 分；按染色强度进行评分：其中棕褐色为3 分，棕黄色为2 分，淡黄色为1 分，无着色为0 分。将阳性细胞所占百分比与染色强度评分相乘，所得乘积为总分。若总评分≤6 分者为低表达，总评分＞6 分 者为高表达。

1.7 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验，计数资料以例（%）表示，比较采用χ2检验，进一步的两两比较采用χ2分割法，相关性分析采用Pearson 相关性检验，P＜0.05 为差异有统计学意义，χ2分割法两两比较时，P＜0.0167 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 子宫腺肌病在位内膜组织中Galetin-3、MMP-9 和VEGF mRNA 的相对表达

分别检测20 例正常对照子宫内膜组织和20 例子宫腺肌病在位内膜组织中Galetin-3、MMP-9 和VEGF mRNA 的相对表达（见表1 和图1），子宫腺肌病在位内膜组织中Galetin-3、MMP-9 和VEGF mRNA 的表达与正常对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），子宫腺肌病在位内膜组织中Galetin-3、MMP-9 和VEGF mRNA 的表达均升高。

2.2 子宫腺肌病在位内膜组织中Galetin-3、MMP-9 和VEGF 蛋白的相对表达

分别检测20 例正常对照子宫内膜组织和20 例子宫腺肌病在位内膜组织中Galetin-3、MMP-9 和VEGF 蛋白的相对表达（见图1 和表2），子宫腺肌病在位内膜组织中Galetin-3、MMP-9 和VEGF 蛋白表达与正常对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），子宫腺肌病在位内膜组织中Galetin-3、MMP-9 和VEGF 蛋白表达均升高。

表1 子宫腺肌病在位内膜组织中Galetin-3、MMP-9 和VEGF mRNA 的相对表达 （n=20，±s）

表1 子宫腺肌病在位内膜组织中Galetin-3、MMP-9 和VEGF mRNA 的相对表达 （n=20，±s）

组别 Galectin-3 MMP-9 VEGF正常对照组 0.350±0.091 0.281±0.089 0.288±0.086子宫腺肌病组 0.506±0.120 0.415±0.144 0.403±0.093 t 值 4.601 3.549 4.055 P 值 0.000 0.001 0.000

2.3 子宫腺肌病在位、异位内膜组织中Galetin-3、MMP-9 和VEGF 蛋白的高表达

分别检测40 例正常对照子宫内膜组织和40 例子宫腺肌病在位、异位内膜组织中Galetin-3、MMP-9和VEGF 蛋白表达（见图2）。与正常对照子宫内膜组织比较，子宫腺肌病异位内膜组织中Galetin-3 和VEGF 蛋白高表达，差异有统计学意义（P＜0.05）；3组MMP-9 蛋白高表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（见表3）。

2.4 子宫腺肌病异位内膜组织中Galetin-3、MMP-9 和VEGF 蛋白高表达的相关性

Pearson 相关性分析结果显示，Galetin-3 和MMP-9 高表达呈正相关（r=0.493，P=0.001），Galetin-3 和VEGF 高表达呈正相关（r=0.616，P=0.000），MMP-9和VEGF 高表达呈正相关（r=0.441，P=0.004）。

图1 Galetin-3、MMP-9 和VEGF mRNA 和蛋白的 相对表达情况

表2 子宫腺肌病在位内膜组织中Galetin-3、MMP-9 和VEGF 蛋白的相对表达 （n=20，±s）

表2 子宫腺肌病在位内膜组织中Galetin-3、MMP-9 和VEGF 蛋白的相对表达 （n=20，±s）

组别 Galectin-3 MMP-9 VEGF正常对照组 0.376±0.121 0.347±0.112 0.359±0.113子宫腺肌病组 0.522±0.151 0.435±0.151 0.476±0.127 t 值 3.381-2.076 3.058 P 值 0.002 0.045 0.004

图2 正常对照子宫内膜、子宫腺肌病在位和异位内膜组织中Galetin-3、MMP-9 和VEGF 蛋白的表达（Envision 二步法 ×100）

表3 Galetin-3、MMP-9 和VEGF 蛋白在子宫腺肌病在位、异位内膜和正常对照内膜组织中表达情况[n=40，例（%）]

3 讨论

子宫腺肌病是指子宫内膜腺体和间质细胞在子宫肌层呈弥漫或局限性生长，引起月经过多、痛经、不孕不育等表现，严重影响患者身心健康，但仍缺乏有效的临床治疗策略[7]。子宫腺肌病的病因和发病机制尚不十分清楚，可能具有较为独特的分子病理学特征[8]，炎症因子、增殖-凋亡失衡、血管生成等可能参与子宫腺肌病的发生[9]，因此，了解其发病机制对寻找有效治疗策略有重要意义。

Galectin-3 是半乳糖凝集素家族中唯一的嵌合型成员，在人体组织中广泛表达，参与细胞的增殖、分化及凋亡过程，以及参与炎症反应调节等多种生物学行为[10-11]。Galectin-3 表达与子宫内膜性疾病如子宫内膜异位症[12]、子宫内膜癌[13]发生密切相关。有研究表明Galectin-3 在血管生成中也发挥重要作用，可调节肿瘤[4]、角膜等[14]多种组织新生血管生成。本研究结果显示，Galectin-3 在子宫腺肌病在位内膜组织中mRNA 和蛋白表达均高于正常对照子宫内膜组织，而异位内膜组织中Galectin-3 高表达率更高，提示Galectin-3 可能参与子宫腺肌病的发生，尤其是内膜异位的发生。

VEGF 作为最强的血管生成因子，其高水平表达与子宫腺肌病发生关系密切，其高表达的致病机制尚不清楚[15]，雌激素可通过诱导VEGF 高表达及血管生成促进子宫腺肌病的发生[16]。MMP-9 是一种重要的基质金属蛋白酶，其高表达与子宫腺肌病的发生密切相关[17]，多种信号通路可通过调节MMP-9 参与子宫腺肌病的发生[18]。MMP-9 和VEGF 还在内皮细胞抗凋亡中发挥重要作用，是子宫腺肌病发生过程中的关键因子[16]，下调MMP-9 的表达降低腺体细胞的侵袭能力[19]。本研究结果显示，MMP-9 和VEGF 在子宫腺肌病在位内膜组织中mRNA 和蛋白表达均高于正常对照子宫内膜组织，两者均在异位内膜组织中高表达且呈正相关，进一步说明两者可能共同参与子宫腺肌病的发生、发展，可能有助于腺体细胞的异位侵袭。

研究表明，Galectin-3 在促进细胞增殖和血管生成中发挥重要作用，Galectin-3 基因敲除可通过减少VEGF 的分泌从而使肿瘤细胞血管生成障碍[20]。Galectin-3 也是MMP-9 重要的转录调节因子，可调节MMP-9 的表达、中断细胞间接触促进上皮细胞运动，如发生侵袭和转移。本研究结果中Galectin-3 和VEGF、MMP-9 在异位内膜中的高表达均呈正相关，提示3 者可能在子宫腺肌症发生、发展尤其是异位侵袭中共同发挥作用，其具体分子调节机制还需要进一步深入研究。

综上所述，Galectin-3、VEGF 和MMP-9 在子宫腺肌病内膜组织中表达升高，3 者在异位内膜组织中均呈高表达且呈正相关，提示3 者高表达可能共同参与子宫腺肌病的发生和异位侵袭，为继续探讨子宫腺肌病的发生机制和新的治疗策略提供参考。