子宫腺肌病中微血管密度与VEGF和VEGFR2的关系

王 珺，彭学勤，龚 芫，申 璇，丁娅妮，苟飞飞，刘祉君，黄 平，李东林

(1.贵州省人民医院 妇科，贵州 贵阳 550002；2.贵州省人民医院 病理科，贵州 贵阳 550002)

子宫腺肌病是妇科常见疾病，多发生于30～50岁，以经量增多、子宫增大伴进行性痛经加重为主要临床表现，子宫腺肌病虽为良性疾病，却具有无限生长、浸润并破坏周围组织的特性。新生血管形成是异位子宫内膜组织浸润性生长的关键，血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)通过影响子宫肌层毛细血管通透性及新生血管形成，增加子宫内膜细胞的迁移、增殖。有学者观察到子宫内膜中，腺肌病内膜-肌层界面处VEGF的表达高于远肌层[1]。研究观察到抑制VEGF生成后病灶中微血管的生成受阻[2]。也发现拮抗血管内皮生长因子受体2(Vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2)后病灶中微血管形成受到抑制[3]。有研究报道子宫腺肌病异位子宫内膜组织中VEGF和FLK1的表达增强，但未对MVD(Microvessel density, MVD)与VEGF、FLK1的相关性作进一步的深入研究[4]。本研究通过免疫组织化学法观察子宫腺肌病病灶中及在位子宫内膜中VEGF、VEGFR2和MVD的表达情况，了解子宫腺肌病中MVD与VEGF 、VEGFR2的相关性，为进一步揭示子宫腺肌病的发生发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本采集 标本取自2016年9月至2019年5月在贵州省人民医院妇科因子宫腺肌病行手术治疗的子宫标本，取子宫腺肌病灶及增生期子宫内膜。患者年龄39～47岁，平均年龄(43.12±4.37)岁，近6月内未服用任何药物，既往月经规律，未放置宫内节育器。子宫腺肌病组标本(40例)：取自因子宫腺肌病切除子宫的病灶组织；子宫腺肌病在位内膜标本取自同一患者子宫腺肌病病灶相邻部位的子宫内膜；对照组标本(30例)：取自行诊断性刮宫术患者的子宫内膜，且经病理证实该子宫内膜无病理性改变者。

1.2 实验方法 将福尔马林固定石蜡包埋的组织制备成4 μm切片，枸橼酸盐缓冲液中以微波高温行抗原修复，采用免疫组化技术Envision二步法，使用抗VEGF、VEGFR2和CD34鼠抗人多克隆抗体和Envision试剂盒说明书进行操作。效应产物为棕黄色颗粒被判定为结果阳性，分布于细胞膜和/或胞浆。组织学评分如下[5]：(1)阳性细胞百分率：阳性细胞百分数<5%，记为0分；5%～35%细胞显色记为1分；36%～65%细胞显色记为2分；细胞显色>66%，记为3分。(2)显色深浅：不显色或显色不清为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，深褐色为3分。将二者评分相加除以2，作为该切片的最终评分，将0、0.5～1和1.5～3分分别定为阴性(-)、阳性(+)和强阳性(++)。用宫颈癌组织作为阳性对照，每组均用PBS代替一抗作阴性对照。CD34在血管内皮细胞胞浆中被标记为棕黄色颗粒，先在低倍视野下观察每张切片选择3个微血管密度大的区域换高倍镜(×200)计数，取平均值计作MVD。

2 结果

2.1 子宫腺肌病病灶和腺肌病在位内膜中微血管密度情况 CD34染色观察到血管上皮细胞膜染色呈棕黄色，MVD在子宫腺肌病组中明显高于腺肌病在位内膜组和对照组，差异有统计学意义(P<0.0167)。MVD在腺肌病在位内膜组与对照组之间差异无统计学意义(P>0.0167，见表1)。

组别例数MVDFP子宫腺肌病 4082.23±1.315.560.012∗腺肌病在位内膜 4063.11±1.215.410.194∗∗对照 3055.42±1.432.350.015∗∗∗

*：子宫腺肌病组与腺肌病在位内膜组比较；**：腺肌病在位内膜组与对照组比较；***：子宫腺肌病组与对照组比较。

2.2 子宫腺肌病病灶和腺肌病在位内膜中VEGF的表达情况 VEGF蛋白表达于子宫内膜腺体上皮细胞的胞浆中，呈棕黄色。VEGF在子宫腺肌病组、腺肌病在位内膜组和对照组中的阳性表达率为100%，其中++阳性率分别为97.5%、40.0%和30.0%，差异有统计学意义(P<0.05)；VEGF++阳性率在子宫腺肌病组中明显高于腺肌病在位内膜组和对照组，差异有统计学意义(P<0.0167)，VEGF++阳性率在子宫腺肌病在位内膜组与对照组中表达无统计学差异(P>0.0167，见表2)。

表2子宫腺肌病病灶和腺肌病在位子宫内膜中VEGF的表达情况

组别例数-+++χ2P子宫腺肌病 4001396.6710.013∗腺肌病在位内膜 40024162.1340.142∗∗对照3002199.9460.002∗∗∗

*：子宫腺肌病组与腺肌病在位内膜组比较；**：腺肌病在位内膜组与对照组比较；***：子宫腺肌病组与对照组比较。

2.3 子宫腺肌病组和腺肌病在位内膜组中VEGFR2表达情况 VEGFR2蛋白显色呈棕黄色，主要位于血管内皮细胞膜及血管壁肌细胞的胞浆中。VEGFR2在子宫腺肌病组、腺肌病在位内膜组和对照组中的阳性表达率分别为100%、87.5%和76.7%，差异有统计学意义(P<0.05)；VEGFR2在腺肌病在位内膜组与对照组之间无明显差异(P>0.0167)；其中VEGFR2++阳性率分别为95.0%、77.5%和26.7%，差异有统计学意义(P<0.05)。VEGFR2++阳性率在子宫腺肌病病灶中表达明显高于腺肌病在位内膜组和对照组，差异有统计学意义(P<0.0167，见表3)。

表3子宫腺肌病病灶和腺肌病在位内膜中VEGFR2表达情况

组别例数-+++χ2P子宫腺肌病 4002388.1320.011∗腺肌病在位内膜 4054313.3470.115∗∗对照 3071586.1590.016∗∗∗

*：子宫腺肌病组与腺肌病在位内膜组比较；**：腺肌病在位内膜组与对照组比较；***：子宫腺肌病组与对照组比较。

2.4 子宫腺肌病病灶中MVD与VEGF和VEGFR2相互关系 在子宫腺肌病病灶中，随着VEGF表达强度的增加，微血管密度明显增加，Spearman等级相关分析表明，MVD与VEGF表达有显著相关性(r=0.72,P=0.012)；随着VEGFR2 表达增加，MVD也随着增加，MVD与VEGFR2表达有显著相关性(r=0.63，P=0.016)。

3 讨论

子宫腺肌病是妇科常见疾病，子宫腺肌病的发生和发展与子宫内异位病灶中微血管形成密切相关，新生血管形成是异位子宫内膜成活生长的关键。VEGF通过影响血管内皮细胞的增殖、迁移而诱导新生血管的形成。本研究观察到VEGF在子宫腺肌病组、腺肌病在位内膜组和对照组各组组织中阳性表达率为100%，但++阳性率在子宫腺肌病组中比较高为97.5%，在对照组中最低为30%。VEGFR2主要存在于微血管内皮胞，在子宫内膜异位病灶中存在VEGFR2受体过表达的状态[6]，当子宫腺肌病病灶中子宫内膜腺上皮细胞分泌VEGF进入病灶周围肌层内与微血管内皮细胞VEGFR2受体结合进而诱导新生血管形成，促进病灶进一步弥漫性侵袭生长。本研究观察到VEGFR2在子宫腺肌病组、腺肌病在位内膜组和对照组中的阳性表达率分别为100%、87.5%和76.7%，其中++阳性率分别为95.0%、77.5%和26.7%，显示VEGFR2与子宫腺肌病有关。近来发现子宫内膜异位症易感位点在4q12 rs17773813[G]，其编码产物为VEGFR2上游信号因子，该位点突变与子宫内膜异位症严重程度相关，揭示VEGF-VEGFR2通路在子宫内膜异位症发病机制中的重要作用[7]。在分析MVD与VEGF、VEGFR2的相互关系时发现，子宫腺肌病病灶中MVD明显高于腺肌病在位内膜和对照组子宫内膜中微血管密度，在子宫腺肌病病灶中随着VEGF表达强度的增加MVD明显增加，随着VEGFR2 表达增加MVD也随着增加，MVD与VEGF、VEGFR2表达呈正相关性。子宫腺肌病病灶中异位子宫内膜腺上皮细胞VEGF表达显著增强，对子宫组织中微血管生成活性增加，与子宫腺肌病病灶的进展密切相关，提示微血管形成在子宫腺肌病的发生发展中发挥重要作用，抗血管生成可能是控制病灶生长和延缓病情进展的重要方向。