HPV感染对宫颈COX-2表达及血PGE2表达水平的影响*

黄晶，潘宜云，周小娟，余英，程细云，刘联斌，申昌梅，罗德平

（赣州市肿瘤医院 1.妇科，2.化疗科，3.检验科，江西 赣州 341000）

人乳头状瘤病毒（human papillomavirus,HPV）感染可导致慢性炎症，炎症相关基因环氧合酶-2（cyclooxygenase,COX-2）及前列腺素E2（Prostaglandin E2,PGE2）在慢性炎症启动致癌信号通路过程中均具有重要作用，且可以相互作用，共同促进肿瘤的增殖、凋亡及转移过程[1-3]。本研究初步探讨HPV 感染对慢性宫颈炎组织、子宫颈上皮瘤（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）和宫颈癌组织中的COX-2 表达水平及血PGE2含量的影响；研究从宫颈炎症病变至宫颈癌转化的不同阶段，HPV 感染的状态及程度与COX-2 和PGE2表达的相关性，揭示HPV 感染与炎症反应在宫颈病变进展及评估宫颈早期病变的重要性。可望为进一步阐明宫颈癌发生、发展的分子生物学机制，为相关疾病的临床诊断、治疗、预后提供理论与实验依据，为宫颈癌的三级预防提供新的视角。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2014年1月—2015年12月赣州市肿瘤医院符合纳入标准的初诊为宫颈癌患者40 例作为宫颈癌组。年龄28～69 岁，中位年龄45 岁；腺癌5 例 （12.5%），鳞癌35 例（87.5%）。按照国际妇产联盟 （Figo）宫颈癌分期，Ⅰ期16 例（40.0%），Ⅱ期10 例（25.0%），Ⅲ期14 例（35%），取标本前均未接受放、化疗。选取同期因妇科疾病治疗或门诊治疗的慢性宫颈炎患者20 例（宫颈炎组）及CIN 患者20 例（CIN 组）。

宫颈癌患者纳入标准：①初诊宫颈癌病理诊断明确患者；②Karhofsky 评分＞70 分；③2 周内未服用消炎痛、阿司匹林等影响前列腺素代谢类药，3 d 内未做阴道冲洗或使用阴道内药物，24 h 内无性生活；④最小年龄18 岁，最大年龄70 岁；⑤患者自愿并签署同意书。

慢性宫颈炎、CIN 患者纳入标准：①慢性宫颈炎、CIN 诊断明确；②2 周内未服用消炎痛、阿司匹林等影响前列腺素代谢类药，3 d 内未做阴道冲洗或使用阴道内药物，24 h 内未进行性生活；③最小年龄18 岁，最大年龄70 岁；④患者自愿并签署同意书。排除标准：①合并其他恶性肿瘤患者；②盆腔有放疗史；③合并有其他严重心、肺、肝、肾疾病史患者；④近期服用COX 抑制剂如：阿司匹林、消炎痛等。研究经本院医学伦理委员会批准，所有患者知情并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 HPV 病毒检测标本的采集HC Ⅱ配套采样器采集保存宫颈细胞标本1 份，受检者取膀胱截石位，窥阴器暴露宫颈后，采用专用宫颈细胞采集刷按顺/逆时针旋转3～5 圈，收集细胞后固定，标本上标注姓名、年龄及病案号相关信息。按照美国Digene 公司HC Ⅱ HPV DNA 检测试剂盒说明书步骤，通过杂交捕获Ⅱ代技术检测HPV（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59 和68 型），DML 2000 微孔板判读器测量样本的相对光单位（relative light unit,RLU），宫颈癌组的RLU/标准阳性对照的RLU 比值≥ 1.0 诊断为HPV 阳性，若比值＜1.0，则判定为阴性。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测COX-2 mRNA术中取新鲜手术切除宫颈病变标本，立即放入液氮中保存备用。Trizol 提取组织总RNA，根据Promega（北京）生物技术有限公司M-MLV 操作说明书逆转录合成cDNA。qRT-PCR 检测组织COX-2 及内参基因GAPDH的表达。引物序列：COX-2 正向引物为5'-CTCCTGTGCCTGATGATTGC-3'，反向引物为5'-CAGCCCGTTGGTGAAAGC-3'；GAPDH 正 向 引 物为5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'，反向引物为5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'。采用20.0 μl 反应体系：SYBR Taq 10.0 μl，正反向引物（2.5 μmol/L） 各0.5 μl，cDNA 1.0 μl，RNase-Free H2O 8.0 μl，反向 引物（2.5 μmol/L）0.5 μl。逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）参数：95℃预变性2 min，95℃变性15 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，总计45 个循环。

1.2.3 ELISA 检测血PGE2含量分别采集CIN 组及宫颈癌组患者空腹静脉血5 ml，5% EDTA 防凝，采血后2 000 r/min 离心5 min，分离血浆，置入-20℃冰箱中冷冻保存待测。ELISA 检测血清PGE2的水平，PGE2检测试剂盒购自美国R&D 公司。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，两组比较采用t检验或秩和检验，相关分析采用Spearman 法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV 病毒载量及COX-2 在不同宫颈组织中的表达

随着宫颈病变进展，HPV 病毒载量也增多，其中宫颈炎组（3.6±0.6）、CIN 组（6.5±1.5）、宫颈癌组（10.4±2.9），CIN 组及宫颈癌组与宫颈炎组比较，差异有统计学意义（F=66.950，P=0.000）（见图1A）；qRT-PCR 检测结果可见不同宫颈组织中COX-2 mRNA 均有一定程度表达，与宫颈炎组（4.1±0.9）比较，CIN 组（7.6±1.3）中COX-2 表达升高，差异有统计学意义（t=9.884，P=0.001）；宫颈癌组（10.5±1.1）中COX-2 mRNA 表达与CIN 组比较，差异有统计学意义（t=-9.052，P=0.000），宫颈癌组中COX-2 mRNA 表达升高。由此可知，COX-2 表达与宫颈癌进展有关（见图1B）。

2.2 宫颈组织中HPV 感染与COX-2、PGE2 mRNA 表达的相关性

根据HPV 感染状态而分的HPV 阴性组和HPV阳性组的COX-2 mRNA 表达水平分别为（4.7±1.2）和（10.2±1.6），HPV 感染阳性宫颈组织中COX-2 mRNA 表达水平高于阴性宫颈组织（t=15.062，P=0.000）（见图2A）；血清PGE2mRNA 表达水平分别为（7.0±1.9）和（10.5±2.3），HPV 感染阳性宫颈组织中PGE2mRNA 表达与阴性宫颈组织比较，差异有统计学意义（t=6.426，P=0.000）阳性宫颈组织中PGF2mRNA 表达升高（见图2B）。

2.3 宫颈癌患者血清PGE2 与HPV 病毒载量的相关性

宫颈癌患者HPV 感染阳性与血清PGE2含量相关，进一步分析得出患者HPV 感染后，随HPV 病毒载量升高，血清PGE2含量亦随之升高，宫颈癌患者血清PGE2与HPV DNA 载量呈正相关（rs=0.257，P=0.003）。见图3。

图1 HPV 病毒载量与COX-2 在不同宫颈组织中的表达 （±s）

图2 宫颈组织HPV 感染与COX-2、PGE2 mRNA 表达的相关性 （±s）

2.4 宫颈癌组织COX-2 mRNA 与血清PGE2 mRNA 表达的相关性

高表达COX-2 mRNA 与血清PGE2mRNA 表达增加相关，本研究结果进一步提示宫颈组织癌中COX-2 mRNA 表达 与血清PGE2mRNA 表达相关，COX-2、PEG2mRNA 表达经正态性检验（P＜0.05）不服从正态分布，采用Spearman 相关性检验分析COX-2、PEG2mRNA 表达之间的相关性，结果显示两者呈正相关（rs=0.684，P=0.000）。见图4。

图3 血清PGE2 与HPV 病毒载量的相关性

图4 宫颈癌组织COX-2 mRNA 表达与血清PGE2 mRNA表达的相关性

3 讨论

宫颈癌是女性第二大常见恶性肿瘤，全球每年的新发例数约为53 万，占所有女性肿瘤的12 %，死亡数达27.5 万例[4]。我国是宫颈癌的高发区，占全世界新发例数的1/5～1/4，每年2 万～3 万妇女死于宫颈癌，严重威胁女性健康[5]。2004年IRAC 指出，HPV感染是CIN 及宫颈癌发生的必要因素，尤其是HPV 16 的持续感染。早期宫颈癌的治愈率在90%以上，早发现早治疗是提高宫颈癌治愈率的关键。HC Ⅱ是目前宫颈癌筛查最常见方法之一，应用于HPV 感染的筛查，具有高度敏感性、客观性及可重复性。许多研究指出CIN 的病变程度与HPV 病毒载量相关，HPV病毒载量越高，宫颈癌发生的风险越高[6-7]，但也有研究指出HPV 病毒载量与宫颈病变无相关[8]，该结论仍存在一定争议。本研究通过HC Ⅱ检测HPV 分型及病毒载量，以HPV 16 感染为主，统计分析宫颈癌HPV 病毒载量最高，CIN 次之，宫颈炎最低。

COX 是前列腺素生物合成过程中的关键限速酶，可催化花生四烯酸转化成各类前列腺素[9]。前列腺素合成后，以自分泌或旁分泌方式释放并结合细胞特异性G 蛋白偶联受体，从而参与调控细胞内的生理活动[10]。COX-2 作为宫颈癌预后的危险因素，与临床分期、淋巴结转移、肿瘤生长浸润及淋巴结转移均密切相关，甚至贯穿宫颈癌病变的整个过程[11-13]。本研究结果显示，COX-2 在宫颈癌及CIN 组织中表达均高于宫颈炎组织，这与早期病变时主要以炎症反应为主这一因素相关。HPV 病毒E6、E7基因可诱导COX-2 异常高表达，这与其E6、E7 蛋白结合性抑制p53 及pRb 蛋白，进而导致DNA 损伤修复受损；E6 蛋白转录激活C-myc基因并与诱导COX-2 表达相关[14-15]。本研究中，HPV感染后可提高COX-2基因的表达。

PGE2是花生四烯酸在COX 作用下的产物之一，其过表达可促进肿瘤细胞增殖、迁移、肿瘤血管生成，抑制肿瘤细胞凋亡，以及弱化宿主免疫功能，邹余粮等[16]研究发现血清及组织PGE2含量与宫颈病变程度呈正相关，这与COX-2 蛋白生成增加或活性增强促进PGE2表达有关。SALES 等[17]证实，COX-2 与PGE2受体在宫颈癌组织中表达同时上调。本研究发现COX-2表达与PGE2呈正相关。此外，HPV 感染阳性宫颈病变组织血清PGE2含量高于HPV 感染阴性，进一步分析发现PGE2含量与HPV-DNA 载量呈正相关，HPV 感染如何促进PGE2表达还有待进一步研究。DEVA 等[18]在白色念珠菌中插入含HPV16 病毒序列，感染阴道上皮系统后促进PGE2合成酶表达，从而提高PGE2表达。研究指出HPV16 E5 蛋白可通过COX-2 依赖途径促进宫颈癌细胞PGE2受体EP4 表达[19]。

目前HPV 检测已列入宫颈癌常规筛查中，但HPV 定量检测存在争议。EINSTEIN 等研究[20]指出在确诊宫颈癌前，HPV 感染且高病毒载量，进展为宫颈癌概率较低病毒载量者高30～60 倍。多种高危型HPV 病毒载量与宫颈癌前病变有关，研究表明[21]HPV16 病毒载量对宫颈癌病变预测最为重要，HPV 16感染者高病毒载量与CIN2+（CIN2 及以上病变）病变级别存在相关（）。HPV定量检测对宫颈癌具有重要预测意义。本研究认为，在已确定HPV 感染患者中进行HPV 定量检测具有必要性，同时COX-2 与PGE2等炎症相关分子水平检测亦有重要临床指示作用。