帕瑞昔布对缺血再灌注后肺组织血红素加氧酶-1表达水平及凋亡程度的影响*

吕强，刘宇，胡云霞，李美亭

（四川省医学科学院·四川省人民医院 麻醉科，四川 成都 610072）

肺缺血再灌注（ischemia reperfusion,IR）时，中性粒细胞在肺内聚集，炎症介质释放，活性氧（reactive oxygen species,ROS）生成增加，引起细胞和组织损伤，甚至发生肺衰竭。

血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）表达增加是细胞应激过程中最重要的保护机制之一。研究显示，HO-1 表达增加可减轻肺IR 损伤及内毒素诱发的急性肺损伤[1-2]。HO-1 的保护作用与其抗氧化、维持微环境稳定、抗炎症反应和抗凋亡有关[3]。

帕瑞昔布为特异性环氧化酶-2（Cyclooxygenase 2,COX-2）抑制剂。ZHANG 等[4]在大鼠肝IR 时发现，帕瑞昔布预处理可抑制炎症反应及氧化应激而减轻肝脏损伤。抑制COX-2 也可减轻脑、肾IR 损伤，以及骨骼肌IR 引起的肺损伤[5-7]。另外，COX-2特异性抑制剂还可经过ROS 途径诱导血管平滑肌细胞和巨噬细胞表达HO-1[8]。帕瑞昔布能否减轻肺IR损伤；是否与肺组织内HO-1 表达变化有关还不清楚。本研究用不同剂量帕瑞昔布处理肺IR，检测肺内丙二醛（Malondialdehyde,MDA）和髓过氧化物酶（Myeloperoxidase,MPO）、肺组织病理改变、凋亡程度及HO-1 表达情况，探讨帕瑞昔布对肺IR 损伤的影响机制，以及是否与剂量相关。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

40 只无特定病原体（SPF）级健康雄性成年SD大鼠（280～300g），购于四川省人民医院实验动物研究所，动物许可证号：SCXKU1172013-15。MDA和MPO 试剂盒（南京建成生物工程研究所），TUNEL试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），Trizol 试剂（美国Invitrogen 公司），逆转录试剂盒（德国Qiagen公司），HO-1 抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与模型复制将大鼠随机分为5 组（每组8 只）：对照组（C 组）、缺血再灌注组（IR 组）、帕瑞昔布低剂量组（L 组，2mg/kg）、帕瑞昔布中剂量组（M组，10mg/kg）及帕瑞昔布高剂量组（H 组，20mg/kg）。C 组仅游离出左侧肺门，其余各组根据文献[9]，复制大鼠单侧肺IR 模型，IR 组单纯阻断左侧肺门；L 组、M 组和H 组分别在阻断左侧肺门前15min，经股静脉注射帕瑞昔布2、10 及20mg/kg。实验过程中，经股静脉给予C 组和IR 组大鼠等体积生理盐水。

1.2.2 标本收集左肺缺血60min，再灌注120min后，放血处死大鼠，立即取出左肺，剪为上、中、下3部分。

1.2.3 肺组织湿重/干重计算取出左肺上段组织后，立即称量湿重，随后放入80℃烘箱内干燥48h，称量干重，并计算湿重/干重。

1.2.4 MDA 及MPO 检测取部分左肺中段组织匀浆，离心后吸取上清液，根据试剂盒操作指南分别检测肺内MDA 和MPO 含量。

1.2.5 观察肺病理改变取左肺下段组织，用4%多聚甲醛固定3d。然后用石蜡包埋并切片，厚度10μm。经HE 染色，并用光学显微镜观察肺泡形态、结构改变及肺间质水肿等变化。

1.2.6 肺组织凋亡细胞检测根据TUNEL 凋亡试剂盒说明书操作完成后，在光学显微镜下随机读取每张切片中的5 个视野，阳性细胞数/总细胞数×100%即为凋亡指数（apoptotic index,AI）。

1.2.7 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测肺内HO-1 mRNA 表达取左肺中段组织，用Trizol 试剂抽提总RNA，逆转录试剂盒逆转录为cDNA，以β-actin 为内参照，引物序列见表1。反应条件为：95℃预变性60s，95℃变性15s，54℃退火20s，70℃延伸40s，40 个循环后，70℃延伸5min。根据每组RT-PCR 的Ct 值，用2-ΔΔCt计算目的基因mRNA 的相对表达量。

表1 HO-1 及β-actin 引物序列

1.2.8 肺内HO-1 蛋白检测使用Western blotting检测HO-1 蛋白质含量。经电泳、转膜、封闭后，加入HO-1 抗体（1 ∶1000 稀释），置于4℃冰箱16h。漂洗后，加入β-actin 抗体（1 ∶10000 稀释），室温孵育1 h。滴加显影液，采集图像。图像用Image J 软件进行分析，相对定量HO-1 蛋白表达丰度。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0 统计软件，经正态性检验，计量资料符合正态分布，以均数±标准差（±s）表示，方差齐时，组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验，方差不齐时采用Games-Howell检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织湿重/干重

各组湿重/干重值比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与C 组比较，其余4 组湿重/干重值均升高（P＜0.05），其中IR 组升高最明显，其次为L 组，而M 组和H 组升高最少（P＜0.05），且M 组和H 组差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.2 MDA 含量及MPO 活性

各组MDA 含量及MPO 活性比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与C 组比较，其余4 组肺内MDA 含量升高，MPO 活性增强；IR 组MDA 含量及MPO 活性增加最多，L 组次之，M 组和H 组增加较少。除M组和H 组组间差异无统计学意义（P＞0.05）外，其余各组间差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.3 肺组织AI 情况

各组AI 比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。C 组肺组织中仅可见少量凋亡细胞，IR 组凋亡细胞增加，L组肺组织中凋亡细胞也增加，但较IR 组减少（P＜0.05），M 组和H 组凋亡细胞也增加，但较IR 组和L 组进一步减少（P＜0.05）。见表2 和图1。

2.4 肺组织病理改变

C 组肺泡结构基本完整；IR 组肺泡破坏严重，肺泡壁增厚明显，伴有大量炎症细胞浸润；L 组肺损伤较IR 组减轻，M 和H 组肺损伤较L 组进一步改善，肺泡较完整，炎症细胞浸润减少。见图2。

2.5 肺组织HO-1 表达水平

各组HO-1 mRNA 和蛋白表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。C 组肺组织中HO-1 mRNA 和蛋白仅有少量表达，IR 组和L 组较C 组高（P＜0.05），M 组和H 组较L 组进一步增加（P＜0.05）。H 组较M组HO-1 mRNA 表达增加（P＜0.05），但HO-1 蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表2 各组湿重/干重、MDA、MPO 及AI 比较 （n=8，±s）

表2 各组湿重/干重、MDA、MPO 及AI 比较 （n=8，±s）

注：1）与C 组比较，P＜0.05；2）与IR 组比较，P＜0.05；3）与L 组比较，P＜0.05

组别 湿重/干重 MDA/（nmol/mg） MPO/（u/g） AI/%C 组 4.29±0.40 1.60±0.15 1.71±0.16 2.14±0.60 IR 组 5.81±0.631） 3.65±0.351） 3.55±0.321） 31.17±3.581）L 组 5.41±0.321）2） 3.21±0.301）2） 2.98±0.251）2） 26.89±3.891）2）M 组 4.93±0.421）2）3） 2.39±0.281）2）3） 2.45±0.161）2）3） 18.16±3.641）2）3）H 组 4.84±0.291）2）3） 2.24±0.231）2）3） 2.30±0.251）2）3） 17.34±2.761）2）3）F 值 14.558 72.471 69.892 63.322 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

图1 各组肺组织凋亡细胞 （TUNEL×400）

图2 各组肺组织病理改变 （HE×200）

表3 各组肺组织HO-1 mRNA 和蛋白表达比较 （n=8，±s）

表3 各组肺组织HO-1 mRNA 和蛋白表达比较 （n=8，±s）

注：1）与C 组比较，P＜0.05；2）与IR 组比较，P＜0.05； 3）与L 组比较，P＜0.05；4）与M 组比较，P＜0.05

组别 HO-1 mRNA HO-1 蛋白C 组 0.14±0.01 0.13±0.01 IR 组 0.33±0.031） 0.31±0.031）L 组 0.37±0.031）2） 0.38±0.041）2）M 组 0.63±0.031）2）3） 0.47±0.031）2）3）H 组 0.68±0.051）2）3）4） 0.52±0.041）2）3）F 值 380.270 71.731 P 值 0.000 0.000

3 讨论

肺IR 时，中性粒细胞在肺内聚集、活化，引起肺组织炎性损伤；另外，ROS 生成增加，还可引起肺组织氧化损伤。该因素均可导致肺血管内皮屏障受损，通透性升高，因此，肺IR 后，使得大量血浆成分渗出，容易出现肺间质水肿。肺组织湿重/干重值可以间接反映液体渗出程度。MDA 为脂质过氧化反应的终末产物，肺IR 时，肺组织中MDA 含量与氧自由基生成呈正相关[10]。在IR 肝损伤研究中发现，选择性COX-2 抑制剂可降低MDA、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）等氧化应激产物的生成[11]。MPO 主要存储于中性粒细胞的嗜天青颗粒内，因此，肺组织中MPO 活性可间接反映肺组织中中性粒细胞浸润程度。

本研究发现，肺IR 后，肺组织湿重/干重值增加；MDA 含量和MPO 活性均升高。给予帕瑞昔布2 mg/kg可降低湿重/干重值，降低MDA 含量和MPO 活性；给予帕瑞昔布10 mg/kg，以上指标降低更多；给予帕瑞昔布20 mg/kg，并未进一步改善，表明帕瑞昔布可减轻IR引起的肺间质水肿，减少中性粒细胞在肺内聚集，抑制脂质过氧化反应，在一定程度上呈剂量依赖性。

本研究结果显示，不同剂量帕瑞昔布预处理均可减轻IR 肺损伤，减少肺组织内细胞凋亡。在IR 损伤、炎症、应激等情况下，多种因素促进COX-2 表达增加，并在组织损伤过程中发挥作用，因此，阻断COX-2 而具有抗炎特性[12]。同样，在肺IR 时，肺内COX-2 表达水平也上升[13]。在呼吸机诱导的肺损伤时，帕瑞昔布可减轻局部及全身炎症反应，降低肺泡上皮通透性、减轻肺间质水肿；还可减少细胞凋亡[14]。所以，帕瑞昔布可能从多个环节减轻IR 肺损伤。

本研究还发现，帕瑞昔布增加IR 肺组织内HO-1表达；随着帕瑞昔布剂量增加，HO-1 mRNA 逐渐增加，然而帕瑞昔布10 mg/kg 和帕瑞昔布20 mg/kg 处理后HO-1 蛋白并无变化。有研究显示，使用高浓度特异性COX-2 抑制剂时，可能会失去选择性，而同时抑制COX-1[15]。因此，大剂量帕瑞昔布，是否会通过COX-1 途径在转录水平影响HO-1 表达还需进一步研究。

HO-1 具有抗炎、抗凋亡和抗氧化等特性。肺缺血后处理可通过增加HO-1 表达，而减轻肺IR 损伤[16]。HO-1 还能增强血管内皮对抗补体介导的损伤而发挥肺保护作用[17]。另外，HO-1 的肺保护功能可能还与其催化代谢产物一氧化碳和胆绿素有关。大鼠肺缺血损伤时，一氧化碳既可减少白细胞瘀滞、纤维蛋白聚集、改善气体交换，提高存活率，又抑制肺内胞外信号调节激酶（ERK）活化、早期反应蛋白-1 表达。因此减少组织因子、Serpine-1、白细胞介素-1 和TNF-α表达[18]。一氧化碳还可诱导抗凋亡蛋白表达，减少Caspase-3 活化，同时激活应激反应转录因子[19]。胆绿素同样也可以通过抗炎、抗凋亡和抗氧化作用保护缺血再灌注肺损伤[20]。

COX-2 抑制剂诱导HO-1 表达可能是通过抑制COX-2 产生的。但在硝普钠介导的细胞毒性研究中发现，COX-2 抑制剂诱导HO-1 表达并不依赖于抑制COX-2[21]。因此，帕瑞昔布的具体机制介导缺血再灌注肺组织内HO-1 的表达，还需要进一步研究。

帕瑞昔布可减轻大鼠肺IR 后肺组织水肿程度，抑制脂质过氧化；减轻IR 肺损伤，减少肺组织内细胞凋亡，上述效应在一定程度上呈剂量依赖性，并且可能与帕瑞昔布增加IR 肺组织中HO-1 表达有关。