不同检测方法对内镜消毒效果监测的应用性研究

宁培勇，纪学悦，丁津华，费春楠，张磊

（1.天津市疾病预防控制中心 预研所，天津 300011；2.天津施特雷生物科技股份有限公司，天津 300350）

内镜是一种常用的医疗器械，由可弯曲部分、光源及一组镜头组成。经人体的天然孔道或手术切口进入，可直接窥视有关部位的变化。随着近代科技的发展，上世纪60年代光学纤维应用于内镜结构，使得内镜诊疗技术得到了飞速发展，作为医生眼和手的延伸，已经达到了“无孔不入”的境界。但是，近年来大量内镜相关感染不断被报道，其中也不乏暴发事件。由内镜相关感染引起的严重危害，在全球范围内是一个新的公共健康威胁，已引起医务人员和患者的高度重视[1]。内镜由于材料特殊、结构复杂及价格昂贵，去除污染物和清洗消毒的难度较高[2]。KOVALEVA[3]报道，由于对内镜清洗消毒等再处理程序不彻底，在使用内镜进行诊疗过程中，会引起多重耐药的肠杆菌、绿脓杆菌等爆发感染。因此，做好内镜的清洗消毒灭菌工作，对防止医源性感染十分重要[4-5]。我国先后制定了相关的标准以规范内镜的再处理过程及评价方法，参见GB15982-2012《医院消毒卫生标准》[6]和WS507-2016《软式内镜清洗消毒技术规范》[7]。本文分别采用胰蛋白胨葡萄糖培养基法（tryptone glucose extract agar，TGEA）和普通营养琼脂法进行终末漂洗水微生物学监测；采用试剂盒过滤集菌法和传统过滤集菌法进行内镜消毒质量微生物学监测，对比不同方法的差异性，以探求实用、简便和可靠的检测方法，从而反应内镜消毒质量真实水平，确保内镜诊疗的安全进行。

1 资料与方法

1.1 一般资料

软式内镜细菌监测采样收集和培养系统-试剂盒过滤集菌见图1[8]，由天津施特雷生物科技股份有限公司提供；Combisart®微生物限度三联不锈钢过滤器-传统过滤集菌，由德国赛多利斯（Sartorius）公司提供。

1.2 研究对象

2018年天津市14个区开展内镜业务的24家医疗机构，每家机构随机抽取1或2条内镜作为研究对象，共30个样本。

1.3 研究方法

图1 软式内镜细菌监测采样收集和培养系统Fig.1 A collecting and culture system for flexible endoscopic bacterial monitoring

1.3.1 取样抽取内镜中心终末漂洗水及内镜洗脱液样品。取样时遵循无菌操作的原则，在水处理系统正常运转的情况下，用75.0%乙醇常规消毒采样口，打开阀门冲洗1 min后，用无菌采样瓶采集终末漂洗水水样300 ml；用含相应中和剂的无菌洗脱液100 ml从内镜活检口灌洗内镜管道，收集洗脱液，4 h内送检。

1.3.2 终末漂洗水微生物学监测各取水样100 ml于无菌过滤杯内，用三联不锈钢过滤器抽滤集菌，取下滤膜分别贴附于TGEA培养基和普通营养琼脂培养基平板表面（当中不得留有气泡）进行培养。TGEA法为20℃培养168 h，普通营养琼脂法为36℃培养48 h，计数菌落数（CFU/100 ml）。

1.3.3 内镜消毒质量监测将洗脱液充分混匀，取洗脱液1 ml接种平皿，将冷至40～45℃的熔化普通营养琼脂培养基每皿倾注15～20 ml，36℃培养48 h，计数菌落数（CFU/平板）。将剩余洗脱液均分各半，分别采用试剂盒过滤集菌法和传统过滤集菌法进行过滤集菌。试剂盒法注入普通营养琼脂培养基，使其均匀覆盖在滤膜表面；传统过滤法将滤膜贴附于普通营养琼脂培养基平板表面（当中不得留有气泡），36℃培养48 h，计数菌落数。当滤膜法不可计数时：菌落总数（CFU/件）=m（CFU/平板）×50（m为两平行平板的平均菌落数）；当滤膜法可计数时：菌落总数（CFU/件）=m（CFU/平板）+mf（CFU/滤膜）（m为两平行平板的菌落数和，mf为滤膜上菌落数）。

1.3.4 信息调查方法采用普查的方法，自主设计相关信息调查表，通过采样人员现场问答、记录的形式，调查内镜中心对内镜清洗消毒效果的自检情况。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计学处理。终末漂洗水、内镜消毒效果菌落数的检出率采用χ2检验；因各组检测结果（菌落数）为非正态分布，故采用四分位间距M（P25，P75）进行统计描述。终末漂洗水、内镜消毒效果利用方差分析比较不同测试方法所得菌落数（Log值）。P＜0.05为差异有统计学意义。采用Bland-Altman分析评价各种方法的一致性。

2 结果

2.1 内镜消毒的不同测试方法菌落数检出率比较

以菌落数≥1 CFU为阳性结果，计为检出。终末漂洗水：TGEA法和营养琼脂法菌落数检出率依次为96.7%和73.3%，差异有统计学意义（χ2=4.71，P=0.030）；内镜消毒效果：试剂盒过滤集菌法和传统过滤集菌法菌落数检出率依次为60.0%和56.7%，差异无统计学意义（χ2=0.07，P=0.793）。

2.2 内镜消毒的不同测试方法菌落数结果

终末漂洗水：TGEA法菌落数（Log10值）高于营养琼脂法，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。内镜消毒效果：试剂盒过滤集菌法和传统过滤集菌法菌落数相近，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.3 内镜消毒的不同测试方法细菌计数一致性分析

采用Bland-Altman图进行两种方法的一致性评价，漂洗水TGEA法与营养琼脂法（n=30）组Log10（菌落数）差值的均值及其标准差（±1.96SD）为0.69（-0.35，1.73），内镜试剂盒过滤集菌法与传统过滤集菌法（n=30）组为-0.07（-0.48，0.33）。各组所得菌落数的比值见表3。终末漂洗水TGEA法与营养琼脂法差值、比值均较大，一致性较差；内镜消毒效果试剂盒过滤集菌法与传统过滤集菌法的差值、比值均值较小，一致性较好，见图2和3。

2.4 内镜中心内镜消毒效果自检情况

内镜中心对终末漂洗水及内镜消毒质量的监测水平较低、采用的检测方法规范性差。见表4。

表1 不同测试方法检测终末漂洗水菌落计数比较[M（P25，P75）]Table 1 Comparison of colony counts on final rinse water detected by different test methods[M（P25，P75）]

表2 不同测试方法检测内镜菌落计数比较[M（P25，P75）]Table 2 Comparison of colony counts on endoscope detected by different test methods[M（P25，P75）]

表3 不同测试方法所得菌落数的比值Table 3 Ratio of colony counts by different test methods

图2 终末漂洗水：TGEA法与营养琼脂法Log10（菌落数）差值的均值及其范围Fig.2 Final rinse water：mean value and range of Log10（colony number）difference between TGEA method and nutritional agar method

表4 医疗机构内镜消毒效果自检情况Table 4 Self-checking of endoscopy disinfection effect in medical institutions

图3 内镜消毒效果：试剂盒过滤集菌法与传统过滤集菌法Log10（菌落数）差值的均值及其范围Fig.3 Endoscope disinfection effect：mean value and range of Log10（colony number）difference between reagent kit membrane filtration and traditional membrane filtration

3 讨论

过滤集菌法，适用于低浓度液体标本菌种分离和计数，可提高细菌检出率。该方法通过加大采样液体量，使采样时对内镜管腔进行充分清洗，经过滤膜富集浓缩后，得到的结果更准确，从而更有利地发现内镜清洗消毒工作中存在的隐患[9]。本研究中，终末漂洗水、内镜消毒质量细菌菌落数的监测，均采用过滤集菌法完成。

MAREK等[10]报导，对内镜终末漂洗水的微生物水平应给以有效的控制，水处理系统要定期进行卫生处理及过氧乙酸消毒，并监测细菌总数、假单胞菌、内毒素、环境分支杆菌及军团菌等。我国于2017年6月1日实施的《软式内镜清洗消毒技术规范》标准[7]，规定了消毒后的内镜应采用纯化水进行终末漂洗，且纯化水菌落总数应≤10 CFU/100 ml。近些年，国外的主流观点倾向于使用低营养培养基、低温和长时间培养检测纯化水的细菌水平，专家认为培养基营养过于丰富会抑制纯化水中的异生细菌，从而降低检出率，造成日常监测的假阴性。本研究中，分别采用TGEA法（参照同属于纯化水的透析用水的检测方法，20℃培养168 h）和营养琼脂法（36℃培养48 h），来对比终末漂洗水的微生物水平，结果TGEA法检出率和菌落数均高于营养琼脂法，差异有统计学意义（P＜0.05），Bland-Altman图显示两法差值、比值均较大、一致性较差。因此，笔者认为，高营养高温（营养琼脂法）培养可能屏蔽了纯化水的真实微生物水平，使得终末漂洗作为内镜消毒处理程序的重要步骤直接影响了内镜的清洗消毒效果，使内镜在诊疗过程中存在潜在性风险。TGEA法低温长时间培养用于终末漂洗水菌落计数，具有很好的临床适应性。

KIM等[11]报导，由于十二指肠镜的结构特殊，造成常规的清洗消毒不达标，从而导致患者间的多重耐药细菌的传播而引起爆发，解决方案除对内镜进行高水平消毒和灭菌处理，还包括加强对内镜消毒质量的监测。本研究参照《医院消毒卫生标准》[6]，采用试剂盒过滤集菌法和传统过滤集菌法进行内镜消毒效果微生物学监测，结果检出率、菌落数相近，差异无统计学意义（P＞0.05），Bland-Altman图显示两法差值、比值均较小，一致性好。软式内镜细菌监测采样收集和培养系统-试剂盒过滤集菌的设计原理，是基于内镜消毒质量监测的全过程应用（采样+检测），系统包括一次性无菌采样瓶、一次性无菌灌注器（含无菌洗脱液）、一次性无菌检测试剂盒和培养基，工作人员实际操作时，无需其他准备即可完成内镜消毒质量监测的全过程，具有操作简单、快捷和高效的特点。采样瓶、试剂盒、抽滤设备的接口均采用内、外螺旋设计，抽滤过程添加无菌空气过滤器，保证整个过滤集菌过程在无菌的条件下完成，故无需苛刻地检测环境、设备及专业的微生物检测人员操作，有很好的临床适用性，甚至可以在内镜中心一并完成采样、过滤集菌、培养和计数等鉴定手段，可便捷、准确地反应内镜消毒质量，保证内镜诊疗的安全进行。

对医疗机构内镜消毒质量自检水平、现状的调查结果显示，终末漂洗水自检率仅为60.0%、内镜监测使用国标规定的过滤集菌法仅占3.3%、使用国标规定量（50 ml）洗脱液灌洗内镜管道占33.3%，整体表现出监测水平较低、采用的检测方法规范性差的现状。医疗机构应加强检验员培训，规范检测方法，提高技术水平，确保内镜消毒质量被准确评估和验证。

综上所述，选用规范的监测方法，客观地反应内镜消毒质量的真实情况，对内镜诊疗过程中的风险控制起着重要的做用。TGEA法低温长时间培养用于终末漂洗水、试剂盒过滤集菌法用于内镜消毒质量监测应被广泛推广。