灰色关联度法研究红蓼抗肿瘤的药用部位研究＊

张紫嫣，包永睿,2,3，王 帅,2,3，李天娇,2,3，刘金瑛，孟宪生,2,3＊＊

（1.辽宁中医药大学药学院 大连 116600；2.辽宁省组分中药工程技术研究中心 大连 116600；3.辽宁省现代中药研究工程实验室 大连 116600；4.北京中医药大学 北京 100029）

红蓼（Polygonum orientale L.）系蓼科（Polygonaceae）蓼属（Polygonum）一年生草本植物，广布于中国各地。红蓼的全草称为荭草，具有祛风除湿、清热解毒的功效，临床上用于风湿性关节炎，冠心病，心胃气痛等症[1-3]。2015版药典中植物红蓼用药部位为其果实水红花子。红蓼的根茎称为荭草根，具有清热解毒，除湿通络的功效，临床上用于痢疾，水肿，风湿痹病，跌打损伤等症[4]；红蓼的花序称为荭草花，具有行气活血，消积，止痛的功效，临床上用于头痛，心胃气痛，腹中痞积等症[5]；红蓼的果实称为水红花子，具有散血消癥，消积止痛的功效，临床上用癥瘕痞块，瘿瘤肿痛，食积不消等症，也可用于治疗胃癌、肠癌、肝癌、胃痛和肝炎等，对糖尿病也有效[6-8]。红蓼全草、根、茎、花和果实均可入药[1,4]，研究红蓼的精准药用部位具有重要意义。

本研究采用HPLC法建立红蓼不同药用部位HPLC指纹图谱，结合灰色关联度分析研究红蓼根、茎、叶、花和果中抗肿瘤发挥药效的精准用药部位[9,10]，为其新药开发及临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试药与仪器

胎牛血清（北京全式金生物技术有限公司）；DMEM高糖培养基（美国GIBCO公司）；二甲基亚砜（Sigma公司）；胰蛋白酶（美国GIBCO公司）；四甲基偶氮唑盐（美国GIBCO公司）；甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；对照品花旗松素（成都曼思特生物科技有限公司，批号：A0082，供含量测定用）；槲皮素（中国药品生物制品检定所，批号：100081-200406，供含量测定用）；山萘酚（中国药品生物制品检定所，批号：0861-200002，供含量测定用）。

实验用6批红蓼于2018年7-10月采集自辽宁沈阳，所有样品均为野生，由辽宁中医药大学中药植物教研室许亮教授鉴定为红蓼（Polygonum orientale L.），每批药材由30株红蓼组成，并按照不同药用部位分为根（G）茎（J）叶（Y）花（H）果（Z）五个混合样品，所有样品于50℃条件下烘干至恒定质量，粉碎过2号筛，充分混匀，放入自封袋避光保存。人肝癌细胞株（HepG2）购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

Aglient1290型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；HD2-BCN-1360B型生物洁净工作台（哈尔滨东联电子技术开发有限公司）；SUNRISE型酶标仪（瑞士TECAN公司）；-80℃超低温冰箱（海尔公司）；NKSY系列恒温水浴锅（常州诺基仪器有限公司）；US AUTOFLOW型CO2培养箱（德国NUAIRE公司）；AE31型倒置相差显微镜（Motic公司）；CP225D电子分析天平（德国Sarto-rius分析天平有限公司，十万分之一）；Milli-q超纯水处理装置（美国Millipore公司）。

1.2 供试品溶液和对照品溶液的制备

取不同药用部位红蓼药材，粉碎（过2号筛），称定10.00 g，置250 mL锥形瓶中，精密加入50%乙醇150 mL，称定质量，回流提取2 h，冷却至室温并补足减失质量，滤过，挥干，用色谱级甲醇配成0.1 g·mL-1（生药量）药液，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

精密称取花旗松素、槲皮素、山萘酚对照品适量，加色谱级甲醇制成质量浓度为0.0050 g·L-1的对照品溶液，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。

1.3 高效液相色谱条件

Aglient1290型高效液相色谱仪，Agilent TC-C18色谱柱（4.6 mm x 250 mm，5 mm)；流动相（A）0.2%磷酸水-（B）甲醇，洗脱梯度（0 min-25 min）30%-68%B；（25 min-50 min）68%-83%；流速1 mL·min-1；检测波长310 nm；柱温设定为30℃；进样量2 μL。

1.4 不同药用部位红蓼指纹图谱的建立

取同一批红蓼药材的同一药用部位，以花旗松素色谱峰（S）为参照，考察方法的精密度、稳定性、重复性RSD值均≤3%，符合指纹图谱方法学考察相关规定。

取6批红蓼药材的不同药用部位，按1.2项下方法制备供试品溶液，按1.3项下色谱条件记录色谱图，将其导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012版），以S1样品为参照图谱，中位数法生成谱图，选择色谱分离度、对称度较好，且能够满足定性、定量要求的色谱峰作为特征峰，Mark峰匹配法进行自动匹配，生成红蓼药材高效液相指纹图谱25个特征峰[11-13]。

1.5 不同药用部位红蓼体外抗肝肿瘤药效

取培养2-3天、处于对数生长期、生长状态良好的肝癌细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，接种于96孔培养板。取不同药用部位红蓼及含10%胎牛血清的DMEM培养液混合配制成生药量1 mg·mL-1的含药培养液铺入孔板继续培养。药物作用24 h后，弃去含药培养液，每孔避光加20 μL（5 mg·mL-1）MTT和180 μL培养液，继续培养4 h后，弃去含药培养液加入150 μL DMSO，用酶标仪在492 nm处扫描，测定吸光值（OD）[14,15]。根据公式

计算不同药用部位红蓼抑制率。

1.6 红蓼体外抗肝肿瘤药效与高效液相色谱灰色关联度研究

应用灰色系统理论建模软件（GTMS3.0）将不同药用部位红蓼高效液相指纹图谱25个特征峰的峰面积与不同药用部位红蓼体外抗肿瘤的抑制率进行关联度分析。

2 结果与分析

2.1 高效液相色谱法建立指纹图谱

根据1.4项下建立不同药用部位红蓼药材对照指纹图谱，得到25个高效液相特征峰，并按保留时间进行对照品比对[15]。特征峰保留时间分别为[1]7.186、[2]12.915（花旗松素）、[3]13.682、[4]14.390、[5]16.943、[6]18.306、[7]19.692、[8]20.679、[9]21.557、[10]25.308（槲皮素）、[11]26.773、[12]29.427、[13]29.850、[14]30.673（山萘酚）、[15]31.673、[16]31.800、[17]34.355、[18]35.047、[19]36.184、[20]38.437、[21]39.812、[22]40.503、[23]41.306、[24]41.952、[25]43.397，相似度均 ＞ 0.9（图1，2，表1）。

2.2 不同药用部位红蓼体外抗肝肿瘤药效

根据1.5供试品溶液制备方法配制不同药用部位红蓼含药培养液，对肝癌细胞进行干预，以抑制率为指标，考察药物干预24 h不同药用部位红蓼对肝癌细胞的增殖抑制作用（表2）。

图1 不同部位红蓼药材对照指纹图谱

2.3 灰色关联度结果

根据1.6并将不同药用部位红蓼高效液相指纹图谱25个特征峰的峰面积与体外抗肿瘤抑制率的相关性按关联系数排列，得出相关系数大于0.7的特征峰保留时间、化学成分及关联系数结果（表3）。

3 讨论

红蓼具有抗肿瘤的作用，其全草、根、茎、花和果实均可入药[1,4]，研究红蓼的精准药用部位具有重要意义。本实验采集6批红蓼全株植物，按照药用部位每批分为根、茎、叶、花和果共30个样品，用灰色关联度法将不同部位红蓼高效液相对照指纹图谱与体外抗肝癌抑制率关联，关联系数大于0.7的特征峰根据对照品比对，10号和14号峰分别为槲皮素和山萘酚，均是具有报道的抗肝癌化学成分，明确了红蓼抗肝癌的物质基础。其中槲皮素是自然界广泛存在的多醇羟基黄酮类化合物，具有明确的抗肝癌作用，机制可能与p53/miR-34a/SIRT1通路有关，近年来受学者广泛关注[16]；山萘酚是一种多酚类抗氧化物，为天然黄酮类化合物的一种，已有文献表明随着山萘酚浓度增加和孵育时间延长导致肝癌细胞HepG2中凋亡因子Cleavedcaspase3的表达逐步增强，促使肝癌细胞HepG2凋亡[17]；根据本实验室前期基础，水红花子中黄酮类成分可对肝癌SMMC-7721细胞具有明显的抑制作用，且抑制作用和时间剂量成线性关系，其作用机制为抑制肿瘤细胞的增殖和诱导该细胞的凋亡[3,11]，皆可说明槲皮素和山萘酚均与肝癌的发生发展有相关性，该实验证明槲皮素和山萘酚是红蓼抗肝癌的主要物质基础。

图2 红蓼对照品比对图谱

表1 不同部位红蓼药材对照指纹图谱相似度评价

根据图2不同部位红蓼药材高效液相对照指纹图谱和表1不同部位红蓼药材对照指纹图谱相似度评价可看出根茎成分相似，但根茎，叶，花和果之间差距较大；根据表2不同药用部位红蓼对肝癌的抑制率考察结果，可看出红蓼抗肝癌药效的相似；实验结果表明，红蓼根茎叶花果成分差异较大，但药效结果相似，对药效贡献较大的色谱峰为红蓼不同药效部位的共有峰高度相似，这提示共有峰为红蓼抗肝癌的作用的物质基础，其非公有峰有可能为红蓼发挥其他药理作用的物质基础，为今后精准治疗提供实验依据。

表2 不同药用部位红蓼对肝癌的抑制作用结果s,n=5

表2 不同药用部位红蓼对肝癌的抑制作用结果s,n=5

注：与空白组比较*P＜0.05。

1 2 3 4 5 6空白0.658±0.036-平均抑制率/%-根（G）32.23茎（J）34.55 38.48叶（Y）花（H）44.39果（Z）OD值抑制率OD值抑制率OD值抑制率OD值抑制率OD值抑制率OD值抑制率0.442±0.023*32.86%0.427±0.034*35.13%0.407±0.047*38.13%0.368±0.039*44.10%0.382±0.033*41.99%0.437±0.065*33.69%0.432±0.066*34.37%0.395±0.057*39.97%0.353±0.054*46.45%0.397±0.062*39.70%0.459±0.046*30.33%0.433±0.021*34.23%0.406±0.051*38.37%0.369±0.061*44.00%0.376±0.029*42.92%0.442±0.033*32.80%0.436±0.039*33.79%0.415±0.045*37.02%0.357±0.062*45.77%0.391±0.044*40.57%0.445±0.057*32.45%0.431±0.069*34.59%0.399±0.022*39.39%0.386±0.032*41.44%0.375±0.047*42.99%0.453±0.045*31.22%0.427±0.044*35.17%0.408±0.048*38.00%0.365±0.022*44.57%0.372±0.036*43.42%42.27

表3 关联度计算结果及关键峰峰号

红蓼全国分布广泛，廉价易得，其中的山萘酚和槲皮素对肝癌药效显著，如作为精准治疗肝癌药物投入生产，将对治疗癌症做出巨大贡献。同时该研究可以为其他中药精准治疗及明确物质基础提供方法和借鉴。