中药茜草抗氧化、抗炎、抗肿瘤不同药用部位精准研究＊

李 慧，包永睿，王 帅，李天娇，孟宪生

（1.辽宁中医药大学药学院 大连 116600；2.辽宁省组分中药工程技术研究中心 大连 116600；3.辽宁省现代中药研究工程实验室 大连 116600）

茜草为茜草科植物茜草Rubia cordifolia L.的干燥根及根茎[1]。现代药理研究表明茜草有效成分具有抗炎、抗癌、抗氧化、止血、抗菌等多种药理作用[2-6]，临床应用广泛。现代研究多集中于茜草根的化学成分及其药理药效研究，有关茜草茎、叶、花的研究鲜有报道。有研究表明茜草叶富含氨基酸多糖，籽实富含天冬氨酸，含量分别是白洋参的4.2倍、野生人参的1.8倍、西洋参的2.3倍，有很大开发价值[7,8]，以茜草藤为主药的中成药“儿泻停”，治疗小儿腹泻极为有效[9]，故茜草的地上部分同样具有研究价值。目前对于茜草地上部分的研究，多以地上全草的化学成分及药理药效研究为主[10]，对其地上部分即茎、叶、花、果实的系统研究较少，故本实验开展了基于抗氧化、抗炎、抗肿瘤三种药效的茜草根、茎、叶、花及果实的精准研究，旨在对各药用部位精准、系统分析，从而明确其各药用部位所对应的精准药效及其药效物质基础，实现茜草各药用部位的精准应用，扩大茜草的药用部位，为茜草资源的开发及临床合理应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 药材与试剂

茜草全株自采于大连市童牛岭风景区，经辽宁中医药大学药用植物教研室许亮教授鉴定为Rubia cordifolia L.；2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二 铵 盐（ABTS）试 剂（批 号 ：F1813046，Aladdin Industrial Corporation）；2,2-联苯基-1-苦基肼基（DPPH）试剂（批号：E1831033，Aladdin Industrial Corporation）；脂多糖（LPS）（批号:813Q031），北京索莱宝科技有限公司）；一氧化氮（NO）检测试剂盒（批号:J20180923EE，上海朗顿生物科技有限公司）；鼠白细胞介素6（IL-6）检测试剂盒（批号：G20180926GH，上海朗顿生物科技有限公司）；抗坏血酸（VC）（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；4-叔丁基茴香醚（BHA）（批号：507C051，北京索莱宝科技有限公司）；绿原酸对照品（批号:110753-201415，中国食品药品检定研究所），异牡荆素、云香柚皮苷、槲皮苷、新橙皮苷、山奈酚、茜草素、羟基茜草素、大叶茜草素对照品品均购自成都普菲德生物技术有限公司，批号分别为140924、 16072904、 151016、 150121、 17011305、17112309、17011011、18030107；异槲皮苷、大黄酸（批号：16040703、131024，四川省维克奇生物科技有限公司），大黄酚对照品（批号：796-9302，中国生物制品检定所）；乙腈为色谱纯（Tedia公司），磷酸为分析纯（天津市科密欧化学试剂有限公司），试验用水为纯净水(娃哈哈纯净水有限公司）。

1.2 细胞株

小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞株，人肝癌HepG2细胞株均购自齐氏生物科技有限公司。

1.3 仪器与设备

Agilent-1100高效液相色谱仪（美国Agilent科技公司）；US AUTOFLOW型CO2培养箱（德国NUAIRE公司）；Sartorius CP225D型电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）；SUNRI SE酶标仪（瑞士TECAN公司）；真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.4 茜草不同部位HPLC指纹图谱的建立

1.4.1 色谱条件

色谱柱：Poroshell 120 SB-C18色谱柱（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）；流动相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱（0-15 min，5%-28%B；15-20 min，28%-30%B；20-25 min，30%-70%B；25-30 min，70%-75%B；30-40 min，75%-85%B；体积流量为1.0 mL·min-1；柱温为30℃；进样量为5 μL，检测波长为254 nm。

1.4.2 样品制备

称取茜草根、茎、叶、花及果实粉末约（过二号筛）5.00 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积分数为60%乙醇溶液50 mL，密塞，称定重量，水浴加热回流提取1 h，室温条件下取续滤液适量，过0.22 μm滤膜，即得样品溶液，取5 μL注入高效液相色谱仪进行分析，各样品剩余滤液分别量取30 mL，真空干燥制备成干膏备用。茜草根、茎、叶、花及果的干膏得率分别为12.0%、11.2%、15.3%、13.6%及18.2%。

1.4.3 对照品制备

称取茜草素、大黄酸、羟基茜草素、大黄酚、大叶茜草素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含茜草素72 μg、大黄酸24.56 μg、羟基茜草素86.34 μg、大黄酚61.60 μg、大叶茜草素93.36 μg的混合对照品1溶液。称取绿原酸、异牡荆素、异槲皮苷、芸香柚皮苷、槲皮苷、新橙皮苷、山奈酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含绿原酸52.67 μg、异牡荆素100.02、异槲皮苷69.00 μg、芸香柚皮苷42.06 μg、槲皮苷57.14 μg、新橙皮苷65.43 μg、山奈酚56.65的混合对照品2溶液。

1.5 抗氧化实验

1.5.1 DPPH方法

称取DPPH适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度为0.400 mg·mL-1的DPPH母液，以甲醇稀释母液制备质量浓度为0.040 mg·mL-1的DPPH工作液备用。称取Vc对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度为0.800 mg·mL-1的Vc母液，依次稀释成质量浓度0.040、0.030、0.025、0.020、0.015、0.010 mg·mL-1的系列Vc对照溶液。称取根、茎、叶、花、果实醇提物适量，加甲醇制成质量浓度为2.000 mg·mL-1的样品溶液，分别稀释成质量浓度为0.031、0.063、0.125、0.250，0.125、0.500、1.000 mg·mL-1的系列样品溶液。取各样品溶液与DPPH工作液各75μL于96孔板等体积混合，在酶标仪517 nm处测定光密度（OD）值，每个样品平行做3个复孔，计算各样品清除率及茜草各部位EC50[11,12]。清除率（%）=[（A空白-A样品）/A空白]×100%。

1.5.2 ABTS方法

称取ABTS、K2S2O8适量，精密称定，加纯水制成浓度分别为 7 mmoL·mL-1、2.45 mmoL·mL-1的 ABTS、K2S2O8溶液，将两溶液等体积混合，置于室温避光孵育12h，即得ABTS+基液。以纯水稀释基液，使其734 nm处吸光度在0.7-0.8之间，制成ABTS+工作液。称取BHA对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度为0.200 mg·mL-1的BHA对照品母液，依次稀释成质量浓度0.244、0.488、0.977、1.953、3.906、7.812 μg·mL-1的系列对照溶液。称取根、茎、叶、花、果实醇提物适量，加甲醇制成质量浓度为2.000 mg·mL-1的样品溶液，分别稀释成质量浓度为 0.031、0.063、0.125、0.25，0.125、0.500、1.000 mg·mL-1的系列样品溶液。取各样品溶液50 μL 与工作液 150 μL 于 96孔板混合，避光反应6 min，在酶标仪734 nm处测定光密度（OD）值，每个样品平行做3个复孔，计算各样品清除率及茜草各部位醇提物EC50[13-15]。

1.6 抗炎实验

1.6.1 细胞培养

将RAW264.7细胞，在37℃，5%CO2条件下，用含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养液传代培养，取对数生长的细胞进行后续试验[16]。

1.6.2 MTT法检测RAW264.7细胞活力

调整RAW264.7细胞悬液密度，使其密度为6×104·mL-1，接种于96孔板内，每孔100 μL。分别设置调零孔、空白对照孔（细胞+培养基）、茜草提取物组（药液质量浓度为20、50、100、200、400 μg·mL-1），每组设定4个复孔。加药后，将96孔板放置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，弃上清，向每孔加入质量浓度为5 mg·mL-1的MTT溶液20 μL，继续孵育4 h后，吸去上清液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150 μL，低速振荡10 min后，在酶标仪490 nm处测量各孔的OD值，细胞活力（%）＝（试验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%，筛选出对细胞活力无明显影响的药液浓度进行之后的实验[17]。

1.6.3 ILISA法检测NO和IL-6含量

将RAW246.7细胞接种于96孔板内，调整细胞密度为1 × 105·mL-1，每孔100 μL，分别设置正常组、LPS组、LPS+茜草各部位醇提物组，每组4个复孔。待细胞贴壁后，正常组每孔加入培养液200 μL，LPS组每孔加入培养液180 μL、LPS溶液20 μL，给药组每孔加入药液（质量浓度200 μg·mL-1）180 μL、LPS溶液20 μL，其中LPS组与LPS+茜草各部位醇提物组中LPS终浓度为500 ng·mL-1。在37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，收集各组上清液，按说明书检测TNF-α和IL-6的水平，具体操作按试剂盒说明书进行[18]。

1.7 抗肝肿瘤实验

人肝癌HepG2细胞，常规培养于10%胎牛血清的DMEM培养液中，取对数生长期细胞，以5×103·mL-1接种于96孔培养板。根据前期预实验结果配制质量浓度为1.00 mg·mL-1的待测样品溶液及质量浓度为5 μg·mL-1的顺铂溶液，待细胞贴壁后加入各待测样品溶液200 μL，每个样品平行做4个复孔，分为阳性药组，空白对照组，茜草不同部位醇提物给药组。药物作用24 h后，在酶标仪490 nm处，测定各孔光密度（OD）值，并计算抑制率。抑制率（%）=[（对照组平均OD值-实验组平均OD值）/（对照组平均OD值-空白对照组平均OD值）]×100%。

1.8 统计学方法

采用ELISAcalc软件计算NO、IL-6含量，拟合模型选用logistic曲线（四参数）模型；采用SPSS21.0软件进行统计分析，组间比较采用ANOVA单因素方差分析，其中P＜0.05为差异有统计学意义，P＞0.05为差异无统计学意义，结果以形式表示。

2 结果与分析

2.1 HPLC指纹图谱的建立

将茜草根、茎、叶、花、果实、混合对照品1和混合对照品2指纹图谱文件导入软件“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012A版），得到谱图，如图1所示。共标定31个色谱峰，从图中可以看出根与茎、叶、花、果之间的色谱峰数量和峰面积差异较大，茎、叶、花、果之间差异较小，茜草根的色谱峰数最多，茎的色谱峰数最少。经化学对照品比对出12种化学成分，分别是5-绿原酸、11-异牡荆素、12-异槲皮苷、15-芸香柚皮苷、18-槲皮苷、19-新橙皮苷、22-山奈酚、23-茜草素、24-大黄酸、25-羟基茜草素、29-大黄酚、31-大叶茜草素（图1，图2）。

2.2 抗氧化活性

2.2.1 DPPH法

DPPH法测定茜草根、茎、叶、花、果醇提物清除自由基能力结果（表1）。随着茜草提取物质量浓度的增加，DPPH自由基清除率也随之增加，经SPSS21.0 Probit分析，计算出各部位EC50值，顺序为果＞根＞茎＞叶＞花，即茜草不同部位清除DPPH自由基顺序为：花＞叶＞茎＞根＞果实；采用SPSS21.0软件进行方差分析，各组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2.2 ABTS法

图1 茜草根、茎、叶、花、果HPLC指纹图谱

图2 混合对照品图

ABTS法测定茜草不同部位醇提物清除自由基能力结果（表1）。随着茜草提取物质量浓度的增加，ABTS自由基清除率也随之增加，经SPSS21.0 Probit分析，计算出各部位EC50值，顺序为果＞根＞茎＞叶＞花，即茜草不同部位清除DPPH自由基顺序为：花＞叶＞茎＞根＞果实；采用SPSS21.0软件进行方差分析，各组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 抗炎活性

2.3.1 细胞活力测定结果

茜草根、茎、叶、花、果醇提物对RAW246.7细胞的活力的影响（图3）。作用时间24 h，药液质量浓度0.013-0.200 mg·mL-1的范围内，各组细胞存活率超过80%，细胞活力无明显影响，故选择药液浓度0.200 mg·mL-1进行后续实验研究。

2.3.2 NO和IL-6含量

经ELISAcalc软件进行计算，logistic曲线（四参数）模型拟合。NO标准曲线拟合方程为：方程：y=（1.697909-0.954709）/[1+（x/11.557466）^1.239991]+0.954709，其中r2=0.999161，IL-6标准曲线拟合方程为：方程：y=（2.693269-0.284933）/[1+（x/33.841778）^1.201142]+0.284933，其中r2=0.991902。最终计算结果如表2所示，正常组细胞上清液中NO、IL-6分泌较少，给予500 ng·mL-1LPS刺激24 h后，NO、IL-6、TNF-α分泌均显著增加（P ＜0.01），茜草根、茎、叶给药组中NO、IL-6的分泌则受到明显抑制（P＜0.05）。茜草根对炎症因子分泌抑制作用最显著，抗炎效果最好，果的抗炎效果最差。其中对于NO分泌的抑制作用，茎、花差异无统计学意义（P=0.294），对于IL-6分泌的抑制作用，各部位相互比较，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。

表1 DPPH、ABTS法测定茜草不同部位醇提物清除自由基能力（清除率/%，xˉ±S，n=3）

图3 茜草不同部位醇提物对RAW246.7细胞活力的影响

表2 茜草不同部位醇提物对NO、IL-6表达的影响（S ，n=3）

表2 茜草不同部位醇提物对NO、IL-6表达的影响（S ，n=3）

注：与LPS模型组比较：*P＜0.05

组别给药剂量/(mg·mL-1）抑制率/%NO_ __ __ _76.5 38.88 48.18 64.72 15.59空白对照组LPS模型组根+LPS茎+LPS叶+LPS花+LPS果实+LPS 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 NO/(μmol·L-1)1.58±0.049*8.17±0.053 2.44±0.036*6.40±0.138*6.08±0.061*6.34±0.057*7.28±0.041*IL-6/(ng·mL-1)8.62±0.108*55.87±0.101 13.13±0.106*34.15±0.064*28.95±0.058*19.71±0.07*47.16±0.071*70.13 21.66 25.58 22.4 10.89 IL-6

表3 茜草不同部位醇提物对HepG2细胞的增殖抑制作用（S，n=4）

表3 茜草不同部位醇提物对HepG2细胞的增殖抑制作用（S，n=4）

注：与空白对照组比较：*P＜0.05

抑制率/%52.23 16.19 0.05 17.86 7.82 43.11—组别茜草-根茜草-茎茜草-叶茜草-花茜草-果顺铂对照组OD平均值0.474 0.831 0.991 0.814 0.914 0.564 0.991标准差0.044 0.061 0.034 0.073 0.067 0.080 0.016

2.4 抗肝肿瘤活性

采用MTT法，检测茜草根、茎、叶、花、果醇提物对肝肿瘤细胞的增殖抑制作用（表3）。从表中可以看出，茜草根提取物对肿瘤细胞的抑制作用最强，其次是花、茎、果实，叶对HepG2细胞无抑制作用（P＞0.05）。

3 讨论

茜草作为一味传统中药，始载于《神农本草经》，并将其列为上品，各本草典籍对于其入药部位的描述以根居多[19]。除古书记载，现代研究也集中于根的化学成分及药理药效研究，对于茜草地上部分的研究较少。虽有相关文献报道地上部分的化学成分[20]，但均是针对全草分析，未对地上部分即茎、叶、花、果进行区分研究。然而，不同的部位所含的化学成分群必然存在差异会导致药效的差异[21]，所以，针对不同的药效评价，应精准地选择中药用药部位，这样既可以减少用药量，还能增强治疗效果。故本课题组提出精准生药学概念，精准生药学是研究生药采收时间、用药部位化学成分差异和不同病症疗效关系的一门交叉学科，是生药学前瞻性的分支。

本实验首先建立了茜草根、茎、叶、花、果醇提取物的高效液相纹图谱，结果发现各部位指纹图谱色谱图峰数量和峰面积存在较大差异，即化学成分的种类及含量有差异，通过化学对照品比对共鉴定出12种成分，包括黄酮及酚酸类7种，醌类5种，其中黄酮类成分与蒽醌类成分在图谱中区分明显，其中茜草根中所含醌类成分较多，茎、叶、花、果中几乎不含有醌类成分，多为黄酮及酚酸类成分。之后进行药效学评价，有文献报道自由基能够降低细胞内抗氧化酶活性，造成活性氧的浓度增加，促进肿瘤的发生，而慢性炎症在癌症的发展中同样起促进作用[22-23]，因此自由基、炎症及肿瘤三者之间存在一定关联性。故本实验进行茜草根、茎、叶、花、果醇提物抗氧化、抗炎及抗肿瘤实验，抗氧化实验结果表明DPPH法与ABTS法结果一致，抗氧化活性顺序均是花、叶、茎、根、果实，经统计学分析，各组间差异有统计学意义；抗炎实验表明茜草根对于炎症因子NO及IL-6分泌抑制作用最明显，差异有统计学意义；抗肝肿瘤实验表明茜草根的效果最好，差异有统计学意义，故笔者推测其抗炎及抗肿瘤药效与其醌类成分密切相关，醌类成分对于炎症及肿瘤的作用靶点可能相似。

综上，茜草根、茎、叶、花、果实化学成分群存在差异，差异的化学成分群是茜草不同部位抗氧化、抗炎、抗肿瘤药效显著差异的重要因素。本实验明确了茜草花、叶的抗氧化作用较好，根的抗炎、抗肿瘤效果最好，故建议抗氧化选择茜草花和茜草叶，抗炎、抗肿瘤选择茜草根。本实验基于抗氧化、抗炎、抗肿瘤药效对茜草不同部位进行了精准研究，为茜草资源的开发及合理应用提供科学依据。