茜草炭的质量标准提升研究

张明童，张艳慧，马潇，宋平顺，王娟弟，杨玲霞，李冬华

作者单位：1甘肃省药品检验研究院、甘肃省中藏药检验检测技术工程实验室、国家药品监督管理局中药材及饮片质量控制重点实验室，甘肃 兰州730070；2保定市食品药品检验所，河北 保定071000

茜草（Rubia cordifolia L.）的用药部位为根及根茎，味苦，寒，归肝经，具有凉血，止血，通经的功效［1］。未炒炭的茜草主要药理作用为清热凉血和活血，但其止血效果相对较差。而炒炭后降低其寒冷特性，增强其固化能力，从而更注重于止血功能。关于茜草的炮制最早记录可以追溯到《雷公炮炙论》，雷公云：“凡使茜根，用铜刀于槐砧上锉，日干。勿犯铁并铅”［2］。茜草在历史上的记录中有多种不同的加工方法，包括净制、炒制、酿制和炒炭等几种方式。而现代其炮制品主要是净制和炒炭。根据《全国中药炮制规范》中茜草炭的炮制方法为“取茜草片或段置锅内，用武火加热，炒至表面焦黑色，内部棕褐色，喷淋清水少许，以将其扑灭，然后将其取出并晾干，直至完全冷却”［3］。这种处理方式能够促使大量的草酸钙针晶分解成易于被人体吸收的钙离子，进而提高凝血酶原的作用效果，加快血液的凝聚进程；同时，通过碳元素的释出，可以减少毛细血管的渗透率，进一步强化其收缩功能和抗出血的效果［4］。同时，现代研究表明经过炒炭处理后，茜草的药理作用，如活血、镇痛和抗炎等，会减弱，但是它的止血作用明显增强［5-9］，而茜草炭中异茜草素有明显的止血作用［10-12］，可作为茜草炭含量测定的评价指标［13-15］。

《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版一部中茜草炭，只收载了性状、鉴别（化学反应）、检查（水分）和浸出物，这些内容并不能全面评估其品质。2022年6—8月采用薄层色谱和高效液相色谱的方法，通过比较茜草和相应的炒炭品的薄层色谱和异茜草素含量的差异，以建立茜草炭饮片的质量标准，并优选茜草炭的炮制工艺。

1 仪器和材料

1.1 仪器 XMTD-4000型水浴锅（北京永光明仪器公司），DHG-9245A型鼓风干燥箱（上海一恒仪器公司），KQ-700TDE型超声波清洗器（昆山舒美仪器公司），LINOMAT5型薄层点样仪（瑞士卡玛公司），2695型高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；XS 204型十万分之一电子天平、ME 204型万分之一电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］。

1.2 材料 乙醇，石油醚（60～90 ℃）、丙酮、甲醇、甲酸和磷酸（国药集团化学试剂有限公司，分析纯），甲醇、乙腈（德国默克股份有限公司，色谱纯）；纯化水（屈臣氏）。异茜草素对照品（成都埃法生物科技有限公司，批号AF21031209）。茜草及相应的炮制品均购自河北仁心制药有限公司，样品信息见表1。10批茜草饮片（编号Q1～Q10）均购自河北仁心有限公司，为不同产地的茜草药材切制的饮片，其中山西4批，陕西3批，河南3批。经主任中药师马潇鉴定为茜草科植物茜草的根及根茎。另外取干燥后的茜草饮片，炒药温度为350～370 ℃，炒5～7 min，至浓烟上冒，表面焦黑色，内部棕褐色时，微喷水，灭尽火星，取出得茜草炭（编号T1～T10）。

表1 茜草及茜草炭的浸出物测定结果

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别 分别取0.5 g茜草和茜草炭粉末，过三号筛，加10 mL甲醇，采用超声处理30 min后，进行滤过。将滤液浓缩至1 mL，得到供试品溶液。同时取异茜草素对照品和大叶茜草素对照品，分别加入甲醇中制成含异茜草素0.5 mg和大叶茜草素0.1 mg的溶液，作为对照品溶液。依照薄层色谱法（《中国药典》2020年版四部通则0502）试验，取上述四种溶液各5 µL，分别在硅胶G薄层板上点于同一位置。采用石油醚（60～90 ℃）-丙酮（2∶1）为展开剂进行展开，取出并晾干，在紫外光灯（365 nm）下进行检视。实验结果显示，茜草炭的薄层色谱和异茜草素对照品的色谱在相应位置上显示相同颜色的荧光斑点，且分离程度和复现性良好。以异茜草素为茜草炭的指标性成分，可明显区分茜草和茜草炭，而茜草炒炭后大叶茜草素变化不明显，不宜作为茜草炭薄层鉴别的指标性成分，见图1。

图1 茜草与茜草炭薄层色谱图

2.2 浸出物 根据2020年版《中国药典》一部醇溶性浸出物测定法（通则2201）项下的热浸法测定，对20批样品进行测定，每批样本平行测定2次，取平均值后分别计算茜草和茜草炭的含量。

本研究中茜草饮片炒炭工艺制成的茜草炭浸出物含量明显降低，10批茜草炒炭后浸出物含量范围为6.3%～10.9%，为茜草饮片的56.4%～63.5%。

2.3 异茜草素含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱柱：资生堂CAPCELL PAK C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）；以乙腈为流动相A，水为流动相B，等度洗脱（50∶50）；流速：1.0 mL/min；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 µL。色谱图见图2。

图2 对照品和茜草炭HPLC图：A为异茜草素对照品；B为茜草炭

2.3.2 供试品溶液的制备 取供试品（过三号筛）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率400 W，频率80 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.3 对照品溶液的制备 精密称取异茜草素适量，加甲醇制成浓度0.82 g/L的对照品溶液，备用。

2.3.4 线性关系考察 分别吸取浓度为0.82 g/L的对照品溶液各0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得到系列浓度的对照品溶液。按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以对照品溶液的浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制线性曲线，其线性回归方程为Y=2 876X+1 464（r=0.999 9）。在8.2～820.0 mg/L范围内与峰面积线性关系良好。

2.3.5 精密度试验 “2.3.3”的对照品溶液被用于精密度的测试中，根据“2.3.1”中的步骤进行了六次重复测定，并将测量到的峰面积记录下来，然后计算了RSD值。实验的结果是RSD仅有0.6%（n=6），表明设备具有良好的精确度和稳定性能。

2.3.6 稳定性试验 对同一批次供试品溶液（即茜草炭T2）进行稳定性考察，按照“2.3.1”项下方法测定，分别在0、4、8、12、16、24 h内测量其峰面积。测的异茜草素含量变化的RSD为1.8%，表明该批次溶液在24 h内稳定。

2.3.7 重复性试验 取茜草炭（T2）供试品约1 g，精密称定，平行6份，按“2.3.2”项下方法制备，并按“2.3.1”项下方法进行测定，测得异茜草素含量的RSD为2.4%，表明该分析方法重复性良好。

2.3.8 加样回收试验 取已知含量的样品（茜草炭T2）约1 g，精密称定，平行9份，置具塞锥形瓶中，按50%、100%、150%的比例分别加入浓度为0.82 g/L异茜草素对照品溶液适量，按供试品溶液的方法制备，计算回收率，见表2。回收率试验结果表明该方法准确可靠。

表2 加样回收实验结果

2.3.9 异茜草素含量测定结果 称取茜草和茜草炭供试品各10批，每批约1 g，精密称定，按“2.3.2”项下方法制备，并按“2.3.1”项下方法进行测定，样品测定2次取平均值，计算茜草和茜草炭中异茜草素的含量，分析炮制前后的变化。结果见表3。茜草炒炭后异茜草素明显升高，茜草中异茜草素含量0.009%～0.017%，茜草炭中异茜草素含量0.065%～0.117%，因此拟定茜草炭中异茜草素的含量限度为0.060%。

表3 异茜草素含量测定结果

3 讨论

《中国药典》2020年版一部茜草炭缺少薄层色谱的定性鉴别项目，本研究通过不同条件试验，最终以石油醚（60～90 ℃）与丙酮（2∶1）作为展剂，置紫外光灯（365 nm）下检视，以异茜草素为茜草炭的特征成分，可明显区分茜草和茜草炭。该方法专属性好、灵敏高、分离度和重现性良好。本研究可为茜草炭标准提升提供科学依据。

茜草炒炭后浸出物含量明显降低，为茜草饮片的56.4%～63.5%，可能是高温使有机物炭化，浸出物含量下降。本研究前期比较了不同炒炭程度对浸出物的影响，结果表明炒轻炭浸出物高于炒重炭，但是仅从浸出物含量的高低评价茜草炭是否炮制完全还存在一定的片面性，因此以什么标准来评价其“炒炭存性”还有待进一步研究。

茜草生用有凉血止血作用，炒炭后能增强止血作用。本研究发现茜草经炒炭后异茜草素含量明显增高，可能是在受热过程中茜草中蒽醌类结构发生改变转化为异茜草素，但是增加与减少的成分之间关系尚有待进一步研究。据文献报道，异茜草素有明显的止血作用，是茜草炭主要止血成分之一［16-20］，因此可以作为茜草炭的含量测定指标。研究建立的含量测定方法简单易行，分离度好、灵敏度高、专属性和耐用性良好。