高效液相色谱法测定不同品种来源陈皮中多甲氧基黄酮含量*

李文东 ，魏 莹 ，赵玉玺 ，张世鹏 ，刘 福 ，杨 兰 △

（1.川北医学院附属医院药剂科，四川 南充 637000； 2.川北医学院药学院药物研究所，四川 南充 637000）

陈皮来源于芸香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培变种的干燥成熟果皮，药材分为陈皮和广陈皮，具有理气健脾、燥湿化痰功效[1]，主产于广东、福建、四川、浙江、江西。陈皮主要含黄酮类、挥发油类和生物碱类等活性成分[2-4]。其中黄酮类有黄酮苷类（如橙皮苷）和多甲氧基黄酮类（如川陈皮素[5]和桔皮素[6]）。现代研究表明，多甲氧基黄酮类成分（川陈皮素、桔皮素）有平喘、抗癌、抗真菌、抗动脉粥样硬化、治疗神经退行性疾病[7-11]等药理作用。中药陈皮的质量主要决定于其活性成分的含量，此外，中药材质量还与产地、品种和采收期等因素相关[3，6，12]。不同产地、不同采收季节和基源陈皮中橙皮苷成分含量存在显著差异[13-14]。为此，本研究中采用高效液相色谱（HPLC）法测定不同产地、不同品种来源陈皮中多甲氧基黄酮的含量，为评价陈皮药材的质量提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent1200型高效液相色谱仪（包括四元泵、在线脱气机、紫外检测器，美国安捷伦公司）；Sartoris BT224S型电子天平（万分之一，赛多利斯科学仪器公司）；Mettle AE240型电子天平（十万分之一，梅特勒公司）。

1.2 试药

川陈皮素和桔皮素对照品（自制，1H-NMR、13CNMR，ESI-MS鉴定，含量采用HPLC峰面积归一化法计算且不低于98%）；甲醇（色谱级，赛默飞世尔科技有限公司，批号为152836），水为纯化水（Millipore水纯化仪，自制）；其他试剂均为分析纯。不同品种来源陈皮均由川北医学院生药教研室杨兰讲师鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Diamonsil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（B）-水（A），二元梯度洗脱（0～6min、60%B，6 ～18 min、60%B→100%B）；流速：1.0 mL/min；检测波长：326 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。在此色谱条件下的色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2.2 溶液制备

称取减压干燥至恒重的川陈皮素对照品和桔皮素对照品适量，精密称定，置同一10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得含川陈皮素19.408 μg/mL和桔皮素9.968 μg/mL的混合对照品溶液。取样品粗粉约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇80 mL，称定质量，水浴加热回流1.5 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

线性关系考察：取混合对照品溶液（含川陈皮素135.201 μg/mL 和桔皮素 71.432 μg/mL）适量，按比例稀释 2，5，10，35，50 倍，即得系列对照品溶液。按拟订色谱条件进样测定。以对照品质量（X，ng）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得川陈皮素、桔皮素回归方程分别为Y川=2.608X川-10.210（r=0.999 9），Y桔=3.816X桔-7.206（r=0.999 6）。结果表明，川陈皮素和桔皮素进样量分别在27.04～1 352.01 ng和14.286～714.320 ng范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取2.2项下混合对照品溶液适量，按拟订色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果川陈皮素、桔皮素峰面积的RSD分别为1.95%和1.74%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：按2.2项下方法制备供试品溶液（12号广东新会），按拟订色谱条件分别在 0，2，4，8，12，24h 时进样测定。结果川陈皮素、桔皮素峰面积的RSD分别为1.73%和1.51%（n=6），表明供试品溶液在24h内稳定。

重复性试验：精密称取同一批样品（12号广东新会），按2.2项下方法制备供试品溶液，共6份，按拟订色谱条件进样测定，按外标法计算含量。结果川陈皮素、桔皮素含量的RSD分别为1.16%和2.64%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量（川陈皮素为0.176%，桔皮素为0.095%）的12号陈皮样品，共6份，精密称定，每份约0.5 g，分别精密加入混合对照品溶液（川陈皮素和桔皮素的质量浓度分别为0.176 5，0.095 3 g/L）各5 mL，按2.2项下方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=6）

2.4 样品含量测定

按2.2项下方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定陈皮中川陈皮素和桔皮素的含量。结果见表2。

表2 不同来源陈皮中川陈皮素和桔皮素的含量（n=3）

3 讨论

检测波长选择：取川陈皮素和橘皮素的对照品溶液置UV-1750型紫外可见分光光度计下，于200～700 nm波长范围内进行扫描，结果川陈皮素和桔皮素在326 nm波长处有最大吸收，故将检测波长设定为326 nm。

色谱条件选择：样品中所含川陈皮素和桔皮素结构相近、极性类似，等度洗脱难以实现同时分离，故采用梯度洗脱，试验考察了多种流动相系统（乙腈-0.1%醋酸水、甲醇-0.1%醋酸水、甲醇-水）。结果显示，甲醇-水能达到分离度的要求，分离时间合适，最后确定流动相为甲醇（B）-水（A），二元梯度洗脱（0～6 min、60%B，6～18 min、60%B→100%B）。

提取条件选择：曾考察了超声提取法和水浴加热回流法在不同提取时间（0.5，1，1.5 h）的提取效果，结果表明，在相同时间超声提取回收率低于水浴加热回流提取回收率；随时间的增加，水浴加热回流提取回收率越高，提取1.5 h后，提取回收率在98%，故本试验中采用水浴加热回流法提取。

不同来源样品的含量测定：化学成分是中药中医临床产生药效的物质基础，由于药材种植产地、基源的不同，内、外界因素导致中药材中的化学成分发生变化，成分的变化必将引起药效的变化。由表2可见，从多甲氧基黄酮的含量角度分析，江西南丰蜜桔、四川红橘、重庆大红袍质量可与新会茶枝柑橘媲美，可结合生药研究报道[15]进行开发利用。目前，对于江西陈皮的研究甚少，柑橘类植物品种多、栽培广，每年产出大量的柑橘水果，果皮也被大量废弃，仅有少部分柑橘品种的果皮被利用。应加强江西陈皮的研究力度，可结合药效，以扩大陈皮的药用资源。