行为学干预对血管性痴呆大鼠脑组织保护及SDF-1、β-catenin表达的影响

邱月 吕威力 邢雪松

(沈阳医学院 1解剖学教研室，辽宁 沈阳 110034；2病理学教研室)

缺血性脑损伤是严重影响人类健康生活的疾病，拥有高发病率、高致残率、高复发率等特性〔1～3〕。脑缺血能促进成年动物大脑神经干细胞(NSCs)的增殖、迁移和分化，一些受损的神经元可被新生的神经元替换，对改善神经功能缺损有积极影响〔4〕。神经生长因子家族的成员脑源性神经生长因子(BDNF)和胶质源性神经营养因子(GDNF)，有研究发现脑组织释放以上两种神经生长因子，对缺血缺氧性脑损伤具有修复作用〔5～7〕。本研究探讨气味穿梭训练干预对血管性痴呆大鼠脑组织保护及基质细胞衍生因子(SDF)-1、β-连环蛋白(catenin)表达的影响。

1 材料和方法

1.1血管性痴呆模型的制备 健康雄性Wistar大鼠，体重均在230 g左右，约8周龄，共计54只。购于沈阳医学院实验动物管理中心。将全部大鼠随机分为3组：假手术组(6只)，模型组(3、7、14、21 d,每组6只)，训练组(3、7、14、21 d,每组6只)。建立血管性痴呆大鼠模型采用两血管阻断加硝普钠法。常规禁食水。术前麻醉采用1%戊巴比妥钠，40 mg/kg腹腔注射，大鼠取仰卧位，碘伏消毒颈前区，行正中切口约为3 cm，分离左、右侧颈总动脉，分离时应防止迷走神经过度牵拉，模型组大鼠注射硝普钠，腹腔注射剂量为2.5 mg/kg，立即用无创动脉夹夹闭双侧颈总动脉，10 min后打开动脉夹，10 min后再次夹闭动脉，10 min后再打开，缝合颈前切口，恒温37℃饲养大鼠，必要时可应用抗生素抗感染。应用多导生物记录仪测量并记录实验动物血压，大鼠平均动脉压103～105 mmHg，硝普钠注射后血压平均值下降至约50 mmHg，约持续2 min，后血压平均值缓慢上升至70 mmHg持续约1 h。在建模过程中采取保温措施将手术动物肛温维持在37℃,因为低温在一定程度上减轻脑缺血损伤。假手术组手术仅分离颈总动脉，不采取阻断及硝普钠降压，余同模型组。造模1 d后训练组开始进行气味训练，此后分别于3、7、14、21 d后处死取材。

1.2气味穿梭训练 本次实验的条件刺激与非条件刺激分别为乙酸异戊酯香味与电流刺激。先将大鼠放入穿梭箱一侧，进行5 min暗适应，后给予持续气味刺激。假设大鼠未逃向穿梭箱另一侧，则给予电流刺激，电流大小约为10 mA，大鼠逃至穿梭箱另一侧(箱底未通电)停止刺激，否则持续电流刺激5 s。下一轮训练前确保气味无残留。造模成功后，第2天开始气味穿梭训练，每次训练进行20轮气味、电刺激。

1.3行为学评分 各组大鼠麻醉清醒后采用Zea Longa法进行神经行为学评分，评分标准为：0分：无神经受损表现；1分：前爪未能完全舒展；2分：大鼠向前走时向两侧晃动；3分：大鼠行走时身体向两侧倾倒；4分：不可自主行走，有意识丧失。去除评分为0分与4分的实验动物，用建模成功大鼠替换以保证每小组大鼠数量恒定，在大鼠缺血再灌注3 d后再次进行行为学评分，记录分析评分结果。

1.4BNDF和GDNF含量的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测 模型组和气味训练组大鼠缺血再灌注3 d后，采用戊巴比妥钠大剂量麻醉，迅速断头取脑，在冰盘上快速剥离大脑双侧皮质，采用冰生理盐水漂洗脑组织，滤纸吸干生理盐水，称重记录详细数据，保存在冻存管中置于液氮中待用。按上述步骤取大鼠脑皮质，准确称重后，加入9倍体积的生理盐水制成10%的匀浆，2 500 r/min离心10 min，取上清液保存于-70℃冰箱。ELISA法检测脑组织中BNDF和GDNF的含量，具体步骤均照说明书推荐进行操作。

1.5SDF-1和β-catenin的免疫组织化学检测 取各组缺血海马组织(AP前囟-3.14～前囟-4.5 mm)，片厚约5 mm，置于固定液中固定超过24 h，采用免疫组织化学染色法(IHC)检测缺血海马组织中 SDF-1和β-catenin的表达情况。羊血清封闭(37℃，30 min)，一抗选用兔抗鼠 SDF-1和β-catenin(4℃，过夜)，滴加二抗(37℃,60 min)，滴加ABC复合物(37℃，60 min)，每步之间均磷酸盐缓冲液(PBS)充分漂洗。二氨基联苯胺(DAB)染色时间不超过10 min，流水洗净染色液，脱水、透明、封片。空白组一抗，采用PBS缓冲液代替。

1.6统计学处理 采用SPSS12.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1行为学评分 假手术组神经功能缺损行为学评分(0.00±0.00)分。训练组评分〔(2.35±0.31)分〕明显低于模型组〔(3.01±0.27)分，P<0.05〕，训练组及模型组行为学评分均显著高于假手术组(P<0.05)。

2.2BNDF和GDNF含量 模型组及训练组与假手术组相比，脑组织BNDF和GDNF明显升高(P<0.05)。与模型组比较，训练组BNDF和GDNF含量明显升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组脑组织中BNDF和GDNF含量比较

与假手术组比较：1)P<0.05;与模型组比较：2)P<0.05；下表同

2.3气味训练对SDF-1结果的影响 假手术组可见极少量表达SDF-1阳性的细胞，分散在海马组织中，3、7、14、21 d各亚组之间比较无统计学意义(P>0.05)。模型组7 d缺血海马SDF-1阳性细胞为增长趋势,大小不均,呈簇状分布。随着缺血再灌注时间逐渐延长，表达SDF-1的阳性细胞减少。与假手术组比较，模型组及训练组3、7、14、21 d阳性细胞明显增高(P<0.05)。训练组3、7、14、21 d海马组织表达SDF-1的细胞均较模型组明显增多(P<0.05)。见表2、图1。

表2 各组SDF-1及β-catenin阳性细胞的平均灰度值

2.4气味训练对β-catenin的影响 假手术组大鼠海马组织β-catenin呈弱阳性表达。模型组第7天β-catenin阳性细胞数较假手术组明显升高，阳性细胞数随着灌注时间的增加而逐渐增多，高表达延续至再灌注后第14天，直至第21天(P<0.05)。训练组大鼠海马神经元细胞质内可清楚观察到棕褐色颗粒，与模型组各亚组比较β-catenin阳性细胞数均明显增多(P<0.05)。见表2、图2。

图1 大鼠海马SDF-1阳性细胞(×200)

图2 大鼠海马β-catenin阳性细胞(×200)

3 讨 论

血管性痴呆是由一系列脑血管因素导致大脑缺血缺氧进而引起的痴呆综合征，以智能衰退、表情淡漠、性格和情绪改变为主要临床表现〔8,9〕。

在小鼠基质细胞中SDF-1首次被分离出来，其主要特点是刺激前 B 细胞发育。存在SDF-1α 和 SDF-β2种亚型，SDF-1α和SDF-β分别编码89个氨基酸和93个氨基酸的多肽，但2种亚型均含有一个 21 个氨基酸组成的信号裂解肽〔10，11〕。多种肿瘤的形成、增殖、转移和血管形成均有SDF-1参与，从而被广泛研究。

Wnt/β-catenin 信号通路在神经再生领域中发挥重要。在干细胞表面Wnt 蛋白和Frizzled受体和低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRPs)结合，通过募集基因转移酶(KAT)3的活化因子CREB 锚定蛋白(CBP)激活转录因子 β-catenin 的转录，从而促进干细胞分化相关基因的表达〔12,13〕。

本研究发现，通过气味穿梭训练能明显降低模型组大鼠的行为学评分，提升脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中BNDF和GDNF的含量，推测提高脑内源性神经营养因子的表达是气味穿梭训练发挥缺血脑保护的作用机制之一。

本实验又通过气味穿梭训练观察对缺血再灌注后大鼠海马SDF-1和β-catenin的表达变化，通过实验数据得出结论，训练组大鼠脑组织SDF-1和β-catenin表达较模型组显著增多，又从一个侧面探讨气味训练通过SDF-1/β-catenin 信号通路发挥缺血脑保护的作用机制。