LncRNA LUCAT1通过靶向miR-199a-5p调控宫颈癌细胞活性、侵袭迁移及其分子机制

胡春艳 朱根海 邢艾文 崔开颖

(海南省人民医院妇科，海南 海口 570311)

卵巢癌发病率逐年增加〔1～4〕。人类基因组仅2%为蛋白编码基因，其余均转录为非编码RNA(ncRNAs)〔5,6〕。其中长链非编码RNA(LncRNA)和微小RNA(miRNA)为ncRNAs的成员，它们在癌症发生发展中的作用已得到普遍认可〔7,8〕。LncRNA肺癌相关转录产物(LUCAT)1在肺癌细胞中表达明显升高〔9,10〕，但其在宫颈癌中的作用尚未见报道。LUCAT1与miR-199a-5p在宫颈癌中的相互作用关系也未曾报道。本研究拟以宫颈癌细胞Hela为研究对象，检测Hela细胞中LUCAT1、miR-199a-5p的表达，观察敲减LUCAT1、过表达miR-199a-5p、抑制miR-199a-5p对Hela细胞增殖、迁移和侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1材料 人宫颈癌细胞Hela、正常宫颈细胞Ect1/E6E7均购自ATCC；DMEM培养基、胎牛血清、CCK-8试剂、胰蛋白酶均购自美国GIBCO公司；LipofectamineTM2000、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒、逆转录试剂盒购自大连Takara公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜购自德国罗氏诊断有限公司；十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺(PAGE)试剂盒、电化学发光(ECL)液和RIPA蛋白裂解液均购自碧云天生物技术公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司；

1.2细胞培养 将人宫颈癌细胞Hela、正常宫颈细胞Ect1/E6E7用含10 %胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃,5% CO2的恒温培养箱中常规培养，待细胞生长至融合度80%左右，用胰蛋白酶消化约1 min，按照1∶3的比例更换培养基，每2 d传代1次。

1.3细胞转染 将敲减LUCAT1的阴性对照(si-con)、敲减LUCAT1(si-LUCAT1)、miR-199a-5p模拟物(mimics)、过表达miR-199a-5p的阴性对照(miR-NC)、si-con+抑制(anti)-miR-199a-5p、si-LUCAT1+anti-miR-199a-5p这些序列按照脂质体LipofectamineTM2000说明书操作步骤要求转染至Hela细胞，序列的设计和合成均由上海吉玛制生物公司完成，分别标记为si-con组、si-LUCAT1组、miR-199a-5p组、miR-NC组、si-con+anti-miR-199a-5p组、si-LUCAT1+anti-miR-199a-5p组，转染6 h后更换培养基常规培养48 h，用qRT-PCR检测转染效率。转染成功后，用于后续试验。

1.4qRT-PCR实验 取适量对数生长期各组细胞，按照RNA抽提试剂盒说明书要求操作提取RNA，进行定量，然后按逆转录试剂盒说明书操作合成cDNA。最后按qRT-PCR试剂盒说明书操作进行LUCAT1、miR-199a-5p检测。用2-△△Ct计算LUCAT1、miR-199a-5p的表达。

1.5Western印迹实验 收集1.2各组细胞，加入裂解液，冰上裂解30 min。12 000 r/min离心10 min，取上清置于EP管，加入5×SDS上样缓冲液，沸水煮沸10 min。电泳后用转膜仪将蛋白转移至PVDF膜；5 %脱脂奶粉将膜封闭2 h，洗膜，加入Ⅰ抗，4℃过夜孵育，洗膜，加Ⅱ抗，4℃ 2 h。加发光液，曝光。

1.6噻唑蓝(MTT)实验 取适量1.3各组细胞，加入20 μl 5 g/L的MTT溶液，培养4 h，然后弃去上清，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，震荡，使结晶溶解，在490 nm波长下检测细胞吸光度(A)。细胞的活力与细胞的A490值呈正比。

1.7Transwell实验 将1.3各组细胞以106个/孔接种于细胞6孔板，培养至融合度75%时，更换无血清培养基培养过夜。调整细胞密度至105个/ml，取100 μl加入上室内，600 μl含血清的培养基加入下室，培养过夜。取出小室，用棉签擦去上室内的细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，甲醇固定30 min，0.1%结晶紫染色20 min，PBS洗涤。显微镜下观察小室下表面附着的迁移细胞数，随机选5个视野计数，取平均值。将Transwell小室上表面铺适量厚度的基质胶，然后按照上述操作方法操作。最后显微镜下观察小室下表面附着的侵袭细胞。

1.8双荧光素酶报告基因检测实验 将荧光素酶报告载体〔psiCHECK2-LUCAT1-野生型(WT),psiCHECK2-LUCAT1-突变型(MUT)〕分别与miR-199a-5p mimics、miR-NC用脂质体法转染Hela细胞，培养5 h后，更换新鲜培养液继续培养，转染48 h。按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书操作步骤要求操作。结果以海参荧光素酶的发光强度与萤火虫荧光素酶发光强度的比值反映miR-199a-5p与LUCAT1的结合力。

1.9统计学处理 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1LUCAT1和miR-199a-5p在宫颈癌细胞Hela中的表达 与Ect1/E6E7细胞相比，Hela细胞中LUCAT1表达显著升高，miR-199a-5p表达显著降低(P<0.05)。见表1。

2.2敲减LUCAT1对宫颈癌Hela细胞活性的影响 与si-NC组相比，si-LUCAT1组Hela细胞中LUCAT1表达显著降低，在48、72 h时细胞活性显著降低(P<0.05)。见表2。

表1 LUCAT1和miR-199a-5p在宫颈癌Hela细胞和正常宫颈细胞Ect1/E6E7中的表达

2.3敲减LUCAT1对宫颈癌Hela细胞迁移、侵袭的影响 与si-NC组相比，si-LUCAT1组Hela细胞迁移数和侵袭数均显著降低(P<0.05)。见表3、图1。

2.4过表达miR-199a-5p对宫颈癌Hela细胞活性、迁移、侵袭的影响 与miR-NC组相比，miR-199a-5p组Hela细胞中miR-199a-5p表达显著升高，在48、72 h时细胞活性显著降低，细胞迁移数和侵袭数均显著降低(P<0.05)。见表4。

表2 敲减LUCAT1表达对转染后不同时间点细胞活性的影响

表3 敲减LUCAT1表达对宫颈癌Hela细胞迁移、侵袭的影响个)

图1 宫颈癌Hela细胞的迁移、侵袭(×400)

表4 过表达miR-199a-5p对转染后不同时间点宫颈癌Hela细胞活性、迁移、侵袭的影响

2.5LUCAT1靶向miR-199a-5p 运用miRcode数据库预测到miR-199a-5p与LUCAT13-UTR存在结合位点(图2)；双荧光素酶活性检测结果显示，与miR-NC组相比，miR-199a-5p组WT-LUCAT1细胞中荧光活性显著降低(P<0.05)，MUT-LUCAT1细胞中荧光活性不受影响(P>0.05),见表5；与si-NC组相比，si-LUCAT1组细胞中miR-199a-5p表达显著升高，与si-LUCAT1+anti-miR-NC组相比，si-LUCAT1+anti-miR-199a-5p组细胞中miR-199a-5p表达显著降低(P<0.05)。见表6。

图2 LUCAT1的3'UTR中含有与miR-199a-5p互补的核苷酸序列

表5 双荧光素酶报告实验

2.6抑制miR-199a-5p逆转了抑制LUCAT1对宫颈癌Hela细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用 与si-NC组相比，si-LUCAT1组Hela细胞在48、72 h时细胞活性显著降低，细胞迁移数和侵袭数均显著降低；与si-LUCAT1+anti-miR-NC组相比，si-LUCAT1+anti-miR-199a-5p组Hela细胞在48、72 h时细胞活性显著升高，细胞迁移数和侵袭数均显著升高(P<0.05)。见表6。

表6 抑制miR-199a-5p逆转了抑制LUCAT1对转染后不同时间点Hela细胞活性、迁移、侵袭的抑制作用

与si-NC组比较：1)P<0.05；与si-LUCAT1+anti-miR-NC组比较：2)P<0.05

3 讨 论

LncRNA在癌症中的调控作用的研究日益增多，其调控机制也越来越丰富，其中包括LncRNA与miRNA相互作用调控癌症的进展〔11〕。LUCAT1在多种癌症中均出现表达异常升高，但在宫颈癌中的作用尚且未知。Thai等〔12〕研究报道，LUCAT1在肿瘤中发挥抑癌作用，其机制与DNA甲基化调控甲基转移酶1有关。Yoon等〔13〕研究发现，长链非编码RNA LUCAT1在食管鳞癌组织和细胞中表达异常上调，且敲减LUCAT1可通过下调食管鳞癌细胞中的DNA甲基化来减少细胞增殖、诱导细胞凋亡和上调肿瘤抑制基因的表达，另外，高LUCAT1表达的患者存活率低于低LUCAT1表达的患者，提示，LUCAT1可作为药物开发的潜在靶标。Yu等〔14〕在卵巢癌的研究中发现，LUCAT1表达上调，且与肿瘤转移和临床分期呈正相关，与卵巢癌患者的存活率呈负相关，此外，敲减LUCAT1可抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭，促进凋亡，另外，LUCAT1通过抑制miR-612促进HOXA13的表达，促进卵巢癌的发展，揭示了LUCAT1/miR-612/HOXA13通路可调节卵巢癌的进展。于贵林等〔15〕报道，LUCAT1在胃癌组织和胃癌细胞中高表达，且与胃癌的分期和5年预后存活率关系密切。本研究运用qRT-PCR法检测了宫颈癌细胞Hela、宫颈细胞Ect1/E6E7中LUCAT1的表达发现，LUCAT1在Hela细胞中的表达明显升高，这与LUCAT1在肺癌、卵巢癌、胃癌中的高表达相吻合；进一步研究发现，敲减LUCAT1可抑制Hela细胞的活性、迁移和侵袭；双荧光素酶报告基因检测实验验证了LUCAT1可靶向负调控miR-199a-5p。

miRNA参与人类多种疾病的发生发展，其中包括癌症〔16〕。miRNA在癌症中发挥癌基因或抑癌基因的作用，但部分miRNA在癌症中具有双条调控功能。miR-199a-5p在不同癌症中发挥的作用也不相同，其在结直肠癌〔17〕、甲状腺乳头状癌〔18〕中发挥抑制癌症恶化的作用，但在胃癌中发挥促进癌症发生发展的作用，其与miR-199a和依赖ATP的染色质重塑复合物(SWI/SNF)的亚基(Brm)经早期生长应答因子(Egr1)双负反馈环作用导致不同肿瘤中miR-199a的功能不同〔19〕。Lee等〔20〕运用实时定量PCR阵列分析宫颈癌组织中的差异miRNA表达发现，miR-199a为宫颈癌中表达上调的miRNA之一，且抑制miR-199a在宫颈癌细胞中的表达可抑制细胞的增殖，增强对抗癌药物顺铂的敏感性。Pereira等〔21〕在宫颈癌的研究中报道，miR-199a在颈小细胞上皮内病变Ⅰ级、颈小细胞上皮内病变Ⅲ级及鳞状宫颈细胞癌组织中的表达量均异常降低。邹阮敏等〔22〕在宫颈癌的研究中发现，miR-199a-3p 和 miR-199a-5p的表达均明显低于正常宫颈组织，且与肿瘤的分化存在相关性，提示miR-199a具有宫颈癌靶向治疗的潜力。本研究运用qRT-PCR法检测了宫颈癌细胞Hela、宫颈细胞Ect1/E6E7中miR-199a-5p的表达发现，miR-199a-5p在Hela细胞中的表达异常降低，这与Pereira等〔21〕、邹阮敏等〔22〕的研究结果相一致，与Lee等〔20〕的研究结果相反；进一步研究发现，过表达miR-199a-5p可抑制Hela细胞的活性、迁移和侵袭；深入研究发现，抑制miR-199a-5p的表达可逆转敲减LUCAT1对宫颈癌Hela细胞的活性、迁移、侵袭的抑制作用。

综上所述，LUCAT1可上调宫颈癌细胞的活性、迁移、侵袭，其机制可能与靶向miR-199a-5p有关，为宫颈癌的精准治疗提供依据。