盐酸氢吗啡酮降低缺血再灌注大鼠心肌损伤

董文理 张郃 廖卫宁 程金红 安宁

(咸宁市中心医院麻醉科，湖北 咸宁 437000)

心肌缺血再灌注损伤(MIRI)是指心肌组织在经历一定时间的缺血后恢复血流供应，心肌损伤加重的一种现象。其可导致代谢异常、心律失常、心肌舒缩功能障碍等，导致心脏发生一系列损伤，目前缺血性心脏病已成为世界范围内引起死亡的一个主要病症〔1〕。盐酸氢吗啡酮是一种新型的强效阿片类镇痛药，具有良好的血流动力学稳定性，可同时保证足够的心肌氧供应，静脉给药后5～8 min就能发挥最大的药效〔2〕。关于盐酸氢吗啡酮对心肌缺血后处理的保护效应研究较少，有研究显示，氢吗啡酮可减轻大鼠MIRI，其保护机制可能与磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/内皮型一氧化氮合酶(eNOS)信号的激活有关〔3〕。氢吗啡酮后处理可通过改善再灌注左室功能、降低心肌损伤相关酶浓度、增加冠脉流量、降低心肌梗死面积，从而减轻大鼠MIRI，其心肌保护作用与抑制线粒体膜转运孔在灌注初期开放有关〔4〕。本研究旨在探讨盐酸氢吗啡酮对MIRI后炎性因子、心肌梗死面积、Toll样受体(TLR)-4 信号及凋亡相关蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1主要试剂和仪器 盐酸氢吗啡酮注射液由湖北宜昌人福药业有限公司生产。2，3，5-氧化三苯基四氮唑(TTC)、乌拉坦、酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒均购自美国Sigma；TLR-4、Bcl-2、Bax和酶切caspase3抗体均购自美国CST。蛋白质凝胶成像系统购自美国Bio-rad。

1.2实验分组及处理 健康SPF级雄性成年SD大鼠108只，体重180～220 g，于23℃、50%湿度条件下饲养。采用随机数字表法分为假手术(S)组、缺血再灌注(I/R)组和盐酸氢吗啡酮预先给药(H)组，每组36只，其中S组只分离股动脉及颈内静脉，不作其他处理。H组在缺血前10 min颈内静脉注射盐酸氢吗啡酮注射液0.2 mg/kg。I/R组颈内静脉注射等容量生理盐水。

1.3肢体I/R致大鼠心肌损伤模型建立 大鼠禁食8 h，不禁饮，腹腔注射25%乌拉坦5 ml/kg麻醉，右颈部开口分离颈内静脉，置管建立静脉输液系统，接微电脑静脉微量输液泵。后肢游离双侧股动脉、股静脉，动脉夹夹闭股动脉近端，并用张力带股鞘下环扎阻断侧支循环。远端股动脉置管测压，血压为0标志缺血成功，肢体缺血2 h，去除动脉夹恢复肢体血供，血压升高为再灌注成功。

1.4生化指标的测定 于再灌注120 min末随机取6只采集动脉血样，4℃，离心10 min，取上清液，-80℃冰箱保存待测。采用ELISA测定血清白细胞介素(IL)-6、IL-10、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)浓度。步骤见ELISA试剂盒说明。

1.5心肌梗死面积测定 于再灌注120 min末，即实验结束后取下离体灌流的心脏，将心房及动脉剪取，保留心室，滤纸吸干称重，于-30℃冰箱冷冻15 min，取出变硬的心脏，将心室从心尖向心底方向剪成1 mm的薄片，共6片，37℃、避光、1%TTC溶液浸泡15 min，取出薄片，正常区呈现砖红色，而梗死区呈现灰白色，将梗死区心肌剪下，滤纸吸干称重。梗死面积(IS)=梗死区重量/心室重量×100%。

1.6心肌组织中TLR-4、Bcl-2、Bax和酶切caspase3蛋白水平检测 于再灌注120 min末取出心肌后，4℃预冷生理盐水冲洗，剥取约50 mg心肌组织，放射免疫沉淀(RIPA)裂解液适量提取组织总蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)测定蛋白浓度，以4∶1比例，将蛋白样品与5×上样缓冲液混合，煮沸变性5 min，取变性蛋白30 μg，每孔道等量，经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，分离后的蛋白经电转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，膜用5%的脱脂奶粉封闭1 h，加TLR-4、Bcl-2、Bax和酶切caspase3抗体，抗体的工作液浓度均为1∶1 000，4℃孵育过夜，加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2 h，洗膜，电化学发光(ECL)显色，显影、定影。应用Image-Pro Plus软件分析。以GAPDH为内参，以目的条带与GAPDH条带灰度值比值为目的蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.7统计学方法 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析和SNK-q检验。

2 结 果

2.1血清IL-6、IL-10、SOD和MDA浓度 与S组比较，I/R组IL-6、IL-10和MDA的浓度均明显升高，SOD浓度明显降低(P<0.05)；与I/R组比较，H组IL-6和MDA浓度均明显降低，IL-10和SOD浓度明显升高(P<0.05)。见表1。

2.2心肌梗死面积 与S组(9.8%±1.7%)比较，I/R组心肌梗死面积(66.1%±5.6%)显著增加(P<0.05)；与I/R组比较，H组心肌梗死面积(30.4%±3.5%)显著降低(P<0.05)。

表1 各组血清IL-6、IL-10、SOD和MAD浓度

与S组比较，2)与I/R组比较：P<0.05；表2同

2.3心肌组织TLR-4蛋白表达 与S组(0.078±0.010)比较，I/R组TLR-4蛋白表达(0.802±0.075)显著增加(P<0.05)；与I/R组，H组TLR-4蛋白表达(0.214±0.018)显著降低(P<0.05)。见图1。

图1 各组心肌组织TLR-4蛋白表达

2.4心肌组织凋亡相关蛋白表达 与S组比较，I/R组Bcl-2蛋白表达显著降低，Bax和酶切caspase3的蛋白表达显著升高(P<0.05)；与I/R组比较，H组Bcl-2的蛋白表达显著升高，Bax和酶切caspase3的蛋白表达显著降低(P<0.05)。见表2和图2。

表2 各组Bcl-2、Bax和酶切caspase3蛋白的相对表达量

图2 各组心肌组织凋亡相关蛋白表达

3 讨 论

离体心脏试验发现多种药物和生物因子具有与药物预处理有关的心肌保护作用，如异氟烷、胰岛素、转化生长因子-β、粒细胞集落刺激因子、腺苷受体激动剂、他汀类等〔5～7〕。吗啡等阿片类药物在动物离体心肌缺血再灌注损伤的实验中亦显示出药物预处理的心肌保护作用。以往对阿片类药物预处理的心肌保护作用的实验研究多在细胞和离体心脏模型水平进行，如吗啡预处理可通过调控miR-133b-5p减轻心肌细胞缺氧再给氧损伤〔8〕；舒芬太尼后处理可能通过上调Bcl-2表达，下调Bax表达，抑制细胞凋亡，从而减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤〔9〕。而在体水平上应用阿片类药物预处理是否仍具有心肌保护作用，尚待进一步研究。盐酸氢吗啡酮是一种新型的强效阿片类镇痛药，是否具有心肌缺血后处理的保护效应尚未明确。本研究结果显示，盐酸氢吗啡酮可提高大鼠MIRI后血清IL-10和SOD浓度，降低IL-6和MDA浓度，降低心肌梗死面积，降低TLR-4 信号，促进Bcl-2表达，抑制Bax和酶切caspase3表达。

心肌炎、心力衰竭、脓毒症、心脏再灌注损伤等多种心血管疾病均与细胞因子的释放有关〔10〕。IL-6是一种具有多种生物活性的因子，由中性粒细胞产生，参与免疫调节及应激反应，有研究表明，缺血及再灌注可诱导心肌细胞产生IL-6〔11〕。IL-10是体内主要的抗炎因子之一，主要由T淋巴细胞和单核细胞产生，可抑制Th1细胞分泌IL-6、肿瘤坏死因子-α等细胞因子〔12〕。氧化应激被认为是I/R引起心肌损伤的一个重要机制，自由基是氧化应激造成MIRI的主要参与者，其反应程度与SOD和MDA有关〔13〕。本研究结果提示，盐酸氢吗啡酮可通过调节炎性因子IL-6、IL-10、SOD和MDA浓度减轻MIRI。

TLRs作为一类介导天然免疫反应的跨膜信号转导受体家族，能够识别特定类型微生物保守的分子成分，引发一系列信号转导，进而导致炎性介质释放，在天然免疫防御中起重要作用，并可最终激活获得性免疫系统〔14〕。目前已在哺乳动物中发现至少有12 种Toll 蛋白，其中TLR-4信号通路在MIRI中发挥重要作用，TLR-4突变后能减弱其后信号转导从而减轻MIRI及炎症反应〔15〕。细胞凋亡又称为程序性死亡，是心肌梗死早期细胞死亡的一个主要形式，最后可导致MIRI。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族的抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白，有研究表明，Bcl-2和Bax的实际浓度在I/R过程中发挥保护或促进细胞凋亡的作用〔16〕。caspase3属于caspase家族成员，是细胞凋亡过程中的效应caspase及凋亡的执行者，其活化将使凋亡进入不可逆阶段〔17〕。川陈皮素后处理可通过Bcl-2、Bax和caspase3表达调节减轻MIRI细胞凋亡〔18〕。本研究结果提示盐酸氢吗啡酮对MIRI心肌细胞凋亡影响可能与调节Bcl-2、Bax和caspase3表达有关。

综上，盐酸氢吗啡酮可通过对炎性因子IL-6、IL-10、MDA和SOD，心肌梗死面积，TLR-4 信号及凋亡相关的Bcl-2、Bax和酶切caspase3表达的调节，从而对MIRI起保护作用。