2型糖尿病不同糖耐量患者血清miR-103的检测和临床应用

臧素纲，陈鑫，韩霜，陈曦，周玉贵

(南通大学附属东台医院检验科，江苏 东台 224200)

2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM）是由复杂的遗传因素和环境因素共同作用的一种糖代谢性疾病。胰岛素分泌缺陷和胰岛素抵抗是T2DM发病机制的两个要素，不同患者其胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷具有的重要性不同，同一患者在疾病进展过程中两者的相对重要性也可能发生变化[1]。T2DM患者的糖耐量可存在单纯空腹血糖受损或（和）单纯糖耐量受损，表现为单纯空腹血糖升高(IFH)，或单纯糖负荷后血糖升高(IPH)，或两者同时升高(IFH/IPH)3种不同状态[2-4]。

microRNAs是一类非编码蛋白质的并可参与基因转录后水平调控的单链小分子RNA。目前，已研究发现作用机制相对明确的，与调节胰岛素敏感性及胰岛素抵抗形成相关的miRNAs有miR-125a、miR-103/107、miR-122、miR-126、miR-181、miR-29、miR-133a 等[5-8]。 本实验应用 poly(A)聚合酶加尾SYBR Green I实时荧光定量逆转录PCR法检测血清miR-103，探讨其在2型糖尿病不同糖耐量模式及正常人间的表达差异和临床应用价值。

1 资料和方法

1.1 一般资料 收集2014年10月至2015年2月南通大学附属东台医院测定空腹血糖和餐后2h血糖的糖尿病患者标本，收集同期南通大学附属东台医院体检中心的健康体检者作为正常对照组。本研究经南通大学附属东台医院伦理委员会批准，且所有实验对象均知情同意。实验分组如下：

a．健康对照组（N组）该组均系本院健康体检者，无糖尿病高危因素，无典型的2型糖尿病症状，空腹血糖＜6.1mmol/L，血总胆固醇＜5.17mmol/L，血甘油三酯＜1.70mmol/L，BMI指数＜24，无重大疾病既往史，其他实验室及影像学检查无异常发现。

b．空腹血糖升高组(i-IFG组)该组符合2型糖尿病诊断标准，空腹血糖FPG≥7.0mmol/L，且OGTT 2hPG＜11.1mmol/L，本组 FPG测定值为7.73±0.80mmol/L，2hPG 测定值为 9.25±1.24mmol/L，HbA1c%测定值为 6.8±1.0。

c.餐后血糖升高组(i-IGT组)该组符合2型糖尿病诊断标准，OGTT 2hPG≥11.1mmol/L，同时空腹血糖FPG＜7.0mmol/L，本组FPG测定值为6.42±0.59mmol/L，2hPG 测定值为 9.25±1.24mmol/L，HbA1c%测定值为 6.6±1.2。

d．空腹血糖及餐后血糖升高组 (IFG&IGT组)该组符合2型糖尿病诊断标准，空腹血糖FPG≥7.0mmol/L，且 OGTT 2hPG≥11.1mmol/L，本组 FPG测定值为9.23±2.51mmol/L，2hPG测定值为16.12±4.10mmol/L，HbA1c%测定值为 8.9±1.7。

1.2 仪器与试剂 日立7600全自动生化分析仪为日本日立公司生产，华臣MQ2000PT糖化血红蛋白仪，Rotor-Gene Q实时荧光定量PCR分析仪生产厂家是德国凯杰 （QIAGEN）公司，miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control，miRNeasy Serum/Plasma Kit，miScript II RT Kit miScript SYBR Green PCR Kit和miScript Primer Assay皆为德国凯杰公司生产。扩增miR-103的引物是hsa-miR-103a-3p，其序列为 AGC AGC AUU GUA CAG GGC UAU GA，也为德国凯杰公司提供。

1.3 方法

1.3.1 总RNA的提取 ⑴变性裂解；⑵氯仿的抽提；⑶沉淀总RNA；⑷RNA酶变性处理；⑸沉淀总RNA；⑹清洗干燥硅胶膜；⑺洗提RNA。

1.3.2 RNA纯度检测

1.3.3 逆转录反应获得cDNA ⑴将15μl逆转录反应混合物分装到各PCR反应管中，再加入5μl模板RNA；⑵在PCR仪上设置逆转录条件37℃下孵育 60min，95℃下孵育 5min。

1.3.4 以cDNA为模板进行PCR扩增反应 ⑴将18μl PCR反应混合物加入各个PCR反应管中，再加入2μl模板cDNA；⑵设置PCR反应程序如下：预变性15min后按变性15sec、退火30sec及延伸30sec三个步骤设置40个循环；⑶开始PCR扩增反应。

1.3.5 标准曲线的制作 本课题采用C.elegansmiR-39的miRNA模拟物制作标准曲线，为绝对定量法。将标准品与待测样本同时进行扩增，扩增后根据标准品的浓度对应的CT值绘制标准曲线，根据标准曲线及待测样本的CT值计算出该样本的绝对含量。

1.4 统计学方法 数据分析采用SPSS 19.0软件进行，将Ct值转换成拷贝数，经方差齐性分析，拷贝数不满足正态分布和方差齐性条件，故用Mann-Whitney U检验进行组间比较。根据血清miR-103的表达量，绘制ROC曲线，评价两种miRNAs的诊断效能。以P＜0.05为差异有统计学意义。计数资料以（±s）表示。

2 结果

2.1 总RNA抽提纯度检测的结果 经过SMA1000微量紫外分光光度计测量，本研究所有标本抽提RNA 溶液的A260/A280比值（1.906±0.089）在1.8-

2.1 范围内，表明RNA的纯度较好，可以用于后续的实验。

2.2 实时定量逆转录PCR扩增曲线及标准曲线poly(A)聚合酶加尾法SYBR Green I实时定量逆转录PCR法检测血清miR-103，扩增曲线呈S型，标准曲线呈线性，见图1。

图1 miR-103扩增曲线及标准曲线

2.3 PCR扩增产物的熔解曲线 miR-103熔解曲线在（77.5±0.2）℃呈现单峰，无引物二聚体及其它非特异杂峰存在，表明PCR反应参数合适，扩增产物特异性好，见图2。

图2 miR-103扩增产物的熔解曲线

2.4 血清中miR-103在四组人群标本中的检测结果 i-IFG组血清miR-103的表达水平均高于i-IGT组的表达水平 （P=0.001），i-IFG组血清miR-103的表达水平均高于IFG&IGT组的表达水平（P=0.001），i-IGT组血清 miR-103的表达水平均高于IFG&IGT组的表达水平（P=0.036），三个病例组血清miR-103表达水平和N组血清miR-103表达水平比较差异有统计学意义 （P=0.015、P=0.046、P=0.001），见表 1。

2.5 miR-103在不同糖耐量模式的诊断效能 在IFG组，血清miR-103在ROC曲线下面积（AUC值）为0.733，诊断敏感性为80.0%，特异性为76.5%，；在IGT组，血清 miR-103在 ROC曲线下面积（AUC值）为0.626，诊断敏感性为64.7%，特异性为70.4；在IFG&IGT组，血清miR-103在ROC曲线下面积（AUC值）为0.768，诊断敏感性为88.2%，特异性为62.5%，见图3。

表1 四组人群血清中miR-103表达水平的比较结果

图3 miR-103诊断不同糖耐量模式的ROC曲线图

3 讨论

2型糖尿病患者的糖耐量可存在单纯空腹血糖受损单纯糖耐量受损，表现为3种不同空腹和餐后高血糖模式。i-IFG主要是由于肝脏胰岛素敏感性下降、肝脏糖生成的增加、早期胰岛素分泌不足和胰高血糖素分泌增加；i-IGT主要是由于外周胰岛素抵抗，进展性的胰岛β细胞功能丧失以及葡萄糖依赖的促胰岛素多肽分泌的减少和胰高血糖素的增加[2-4，9，10]。 目前主要是通过测定 FPG 和进行OGTT试验和糖化血红蛋白等检验、检测项目对不同糖耐量水平进行鉴别诊断，但是这些检测项目都不同程度存在对患者进行多次采血和多次检测的繁琐，并且存在患者检验前的准备、采血时间等质量控制难以标准化的缺点。因此学术界探寻诊断2型糖尿病不同糖耐量水平相关的新型生物学检测标志物一直是个热点。

Trajkovski等[11]进行动物实验时发现miR-103可以调节胰岛素的敏感性，沉默miR-103可以改善糖稳态和胰岛素敏感性，miR-103被抑制后可以使miR-103靶基因Caveolin-1上调，继而提高胰岛素信号，降低脂肪组织的大小，增加胰岛素刺激的糖摄取。

本实验中miR-103在三个病例组与对照组比较差异有统计学意义 （P=0.015 0.046 0.001，P＜0.05），三个病例组间的比较差异有统计学意义（P=0.001 0.001 0.036，P＜0.05）。i-IFG 组的表达量高于N组，i-IGT组和IFG&IGT组低于N组，且三个病例组miR-103的表达量依次下降，出现这样的结果可能是因为i-IFG组是空腹血糖异常，主要与胰岛素靶器官肝脏调节血糖的功能有关，出现了胰岛素敏感性下降和抵抗，而i-IGT组和IFG&IGT组都存在糖负荷后糖代谢异常，miR-103主要是通过胰岛素外周靶器官脂肪组织和肌肉进行调节糖负荷后的血糖水平，可能是调节的方式不一样，与血糖代谢的负反馈有一定的关联，也可能确定病例组时没有考虑到未知的影响因素 （如病例的数量、病人的用药情况及并发症等因素），具体机制有待今后实验进一步的探讨。ROC曲线下面积值在0.50～0.70时有较低准确性，在0.70～0.90时有一定的准确性，在0.90以上时有较高准确性。本文i-IFG组血清miR-103在 ROC曲线下面积（AUC值）为0.733，IFG&IGT组血清miR-103在ROC曲线下面积分别为0.768，灵敏度比较高，提示miR-103在2型糖尿病诊断和不同糖耐量水平模式的鉴别诊断有一定的临床价值，可以作为2型糖尿病治疗用药方案选择的生物学标志物，糖化血红蛋白可以反映过去6～8周的平均血糖水平，是监视血糖水平可靠的指标[12]，但是它既受空腹血糖和餐后血糖水平共同影响，也与高血糖状态的持续时间有关系，在2型糖尿病不同糖耐量水平的诊断和鉴别诊断的价值并不高，本实验miR-103在这一层面上是有一定的优势，可以与糖化血红蛋白的进行联合检测，提高临床应用价值。4结论

血清miR-103在2型糖尿病不同糖耐量水平各分组中的表达情况是i-IFG组＞N组＞i-IGT组＞IFG&IGT组，miR-103在病例组与对照组的表达水平差异有统计学意义，且各病例组间miR-103的表达水平的差异亦有统计学意义。血清miR-103可作为2型糖尿病不同糖耐量水平的新型生物学标志物，对2型糖尿病和2型糖尿病不同糖耐量水平的诊断、鉴别及治疗方案的选择具有一定的临床应用价值。