一种国产血液核酸筛查系统的性能验证

冯娟

(安阳市中心血站，河南 安阳 455000)

血站血液检测具有自动化、标准化等特点与要求，为保障血液检测质量，《血站技术操作规程（2015版）》要求实验室应在正式常规检测前对所采购的检测设备、试剂、质控品进行性能评价，以能够达到所要求的性能标准。《医学实验室质量和能力认可准则》（ISO15189：2012）中指出实验室应评估工作所选用的方法和程序，确定设备能够达到所要求的性能标准，通过获取客观证据（以性能特征形式）证实检验程序的性能与其声明相符。国内学者对检测系统的性能评价多集中于精密度、准确度、灵敏度、特异性等性能参数[1]。本研究针对一种国产血液核酸筛查系统进行性能验证，以确认该检测系统在本实验室的适用性。

1 材料与方法

1.1 核酸标准物质和血清盘 应选择参考血清盘，以保证性能验证结果的量值溯源。参考血清盘应包含具有不同分析物浓度的临床标本。核酸国家二级标准物质（北京康彻思坦生物技术有限公司）批号：201604001；核酸系列血清评价盘（北京康彻思坦生物技术有限公司）批号：201605002、201605003。

1.2 试剂与仪器 主要试剂：乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（HIV-1）核酸检测试剂盒 （PCR-荧光法）（上海浩源生物科技有限公司）；主要仪器：ChiTas BSS1200核酸血液筛查系统（上海浩源生物科技有限公司）；ABI7500实时荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司）；BSC-1500ⅡB2-X生物安全柜 (济南鑫贝西生物技术公司)；TDL5B低速冷冻离心机(长沙英泰仪器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 一般要求 在性能验证前，应选择国家批准使用的检测设备、试剂。试验开始前，按要求对仪器进行安装、维护校准、人员培训，保证设备在正常状态下进行。

1.3.2 准确度验证 核酸定性试验准确度采用阴、阳性符合率来验证。选取PT血清盘中8例阴性样本与28例阳性（HBV 11例、HCV 10例、HIV 7例）样本按照3例阳性、1例阴性模式交替排放，采用混检和单检模式进行检测，计算混检、单检模式阴、阳性结果符合率。阴性符合率=（非反应性样本/阴性样本）×100%，阳性符合率=（反应性样本/阳性样本）×100%。

1.3.3 分析灵敏度验证 选取厂家所标明检出限4倍的标准物质，用阴性血浆进行梯度稀释后分别进行32次单检，计算每个稀释度的命中率Hi，Hi=Npos/Ntot(Npos指第i稀释度的阳性结果数，Ntot为第i稀释度的重复检测总数)[2]，利用SPSS统计软件进行probit回归分析，计算95%的检出限及相关置信区间。

1.3.4 精密度验证

1.3.4.1 批内精密度 将标准物质HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA 浓 度分别 为 5IU/ml、50IU/ml、250IU/ml样本在同一批重复单检20次，计算Ct值的标准差和变异系数，变异系数=Ct值的标准差/Ct平均值。

1.3.4.2 批间精密度 将标准物质HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA 浓 度 分 别 为 200IU/ml、1000IU/ml、2000IU/ml样本连续单检 10d，每天 2次，计算Ct值的标准差和变异系数，变异系数=Ct值的标准差/Ct平均值。

1.4 统计学方法 应用SPSS 19.0软件将样本命中率结果进行probit回归分析。

2 结果

2.1 HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA 准确度验证 选取PT血清盘中8例阴性样本与28例阳性样本，采用混检和单检模式分别进行检测。8例阴性样本，HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA 混检和单检结果均为非反应性，符合率为100%；28例阳性样本，不同含量样本分别进行HBV-DNA、HCVRNA、HIV-RNA混检和单检，结果均为反应性，符合率为100%。见表1。

2.2 HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA 样本命中率结果 选取厂家所标明检出限4倍的标准物质，用阴性血浆进行梯度稀释后分别进行32次单检，计算每个稀释度的命中率。标准物质浓度（IU/ml）为 ：25.2、12.6、6.3、3.2、1.6、0.8 分 别 进 行 HBVDNA单检，命中率 （%）分别为：100.00、100.00、100.00、96.88、53.13、28.13； 标准物质浓度（IU/ml）为：93.2、46.6、23.3、11.7、5.9、3.0 分 别进行 HCVRNA单检，命中率 （%）分别为，100.00、100.00、100.00、93.75、56.25、15.63； 标准物质浓度（IU/ml）为：190.4、95.2、47.6、23.8、11.9、6.0 分别进行 HIVRNA单检，命中率 （%）分别为：100.00、100.00、100.00、87.50、40.63、9.38。 见表 2。

2.3 HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA 分析灵敏度验证 根据标准物质每个稀释度的命中率，利用SPSS统计软件进行probit回归分析，计算95%的检出限及相关置信区间。HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA的 95%的检出限分别为 3.63IU/ml、12.71IU/ml、25.49IU/ml；95%的 可 信 区 间 分 别 为[2.51 ～5.42IU/ml]、 [9.82 ～23.38IU/ml]、 [23.65 ～49.29IU/ml]。 见表 3。

2.4 HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA 精密度验证 将标准物质HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA浓度分别为 5IU/ml、50IU/ml、250IU/ml样本在同一批实验重复单检 20次，Ct值的标准差为：0.73、0.44、0.73；变异系数为：2.08%、1.18%、1.93%；将标准物质 HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA 浓度分别为 200IU/ml、1000IU/ml、2000IU/ml样本连续单检 10d， 每天 2 次，Ct值的标准差为：0.62、0.27、0.61；变异系数为：1.86%、0.83%、1.62%；批內和批间精密度变异系数小于生产商声明的变异系数。见表4。

表1 ChiTas BSS1200核酸血液筛查系统HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA准确度验证结果

表2 ChiTas BSS1200核酸血液筛查系统HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA样本命中率结果

表3 ChiTas BSS1200核酸血液筛查系统HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA分析灵敏度验证结果

表4 ChiTas BSS1200核酸血液筛查系统HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA精密度验证结果

3 讨论

性能验证，即使用某特定检测试剂或系统的实验室按照所提供的试剂盒或检测系统说明书使用时，能复现生产厂家所宣称的检测性能，是临床检验质量管理的重要内容之一[3]。系统检测的最低分析物浓度为分析灵敏度或称检出限，是评价分析方法测试性能的重要指标。近年来，隐匿性HBV感染（OBI）越来越受到关注[4]。隐匿性HBV感染是乙型肝炎病毒感染的一种特殊形式，在献血者中广泛存在，给血液安全带来隐患。患者的血清病毒一般保持在较低水平[5]，以至于常规PCR不易检出。国外学者提出HBV DNA检测下限为10IU/ml[6]，因此高灵敏度及高特异性的诊断方法对隐匿性感染的检测非常重要[7]，对于我国HBV高流行率的国情[8]，高灵敏度的核酸检测试剂显然是符合血液安全要求的。本次试验中，其95%检测下限的4倍、2倍、1倍浓度的样本检出率为100%，无法进行probit分析，因为当稀释度命中率处于极端水平（＞0.95）时，应增加更低浓度的稀释水平，避免影响probit模型的吻合质量。在增加到0.5倍浓度时，出现未检出样本，通过probit分析能够在给定的置信度内可靠地计算出被分析物的最低浓度。本次性能验证中检出限低于试剂说明书标定值，分析原因可能为：⑴本试验所用的阳性血浆为国家二级标准物质，试剂厂家采用的是WHO国际标准物质，标准性与溯源性有所不同；⑵所选用的样本数量不同，本研究每个浓度有32例样本，试剂厂家则选用了100例样本进行检测，不同的样本数量也是造成检出限结果差异的因素。以上数据证明，厂家标明的检出限含量，本试验为100%检出，符合试验要求。

循环阈值Ct值与病毒模板起始拷贝数的对数存在线性关系，因此可用Ct值计算实验CV值，进行精密度验证。本次实验中，HBV-DNA、HCVRNA、HIV-RNA批间精密度CV值分别为：1.86%、0.83%、1.62%，小于批内精密度CV值：2.08%、1.18%、1.93%，分析原因为：⑴标准物质病毒含量不一致，不同浓度样本的精密度存在差异。较低浓度水平样本测量误差可能不遵从正态分布，稳定性差，进而影响实验数据的精密度。⑵批內精密度实验是在装机后进行的，设备尚在磨合期，后期批间精密度实验时，设备运行正常，状态稳定性有所提高。尽管如此，批內、批间精密度均低于厂家标明的CV值，说明该系统符合实验要求，检测结果具有良好的重复性。

不同的检测项目和检测系统需要选择不同的方法学进行性能验证。血液核酸筛查系统为定性试验，且使用国家标准方法，临界值是唯一的医学决定水平[9]，故性能验证主要为分析灵敏度（检出限）、准确度、精密度，使用参考血清盘、能力验证样本结合常规实验室检测样本，可以提供更有意义、更可靠的验证结果。性能验证应在满足法规和技术要求的基础上，注重实效性，避免不充分或过度验证。此外，性能验证不能一劳永逸，实验室除在血液检测方法使用之前对检测系统进行确认外，还应在一定使用周期内再次进行性能验证，以便识别使用过程中产生的偏差[10]。性能验证是一项需要持续开展的质量活动，保障血液检测过程监控与持续改进。