动脉粥样硬化患者外周血单个核细胞ABCA1基因表达及其临床意义

莫燕芳，王洋洋，梁洁玲，李海珠，陈立强

(肇庆市第一人民医院检验科，广东 肇庆 526000)

动脉粥样硬化主要是由于体内胆固醇水平上升并造成在巨噬细胞内堆积，产生慢性持续性炎症反应并且在血管内壁沉积而导致血管硬化的疾病[1]。 研究表明ATP结合转运体 （ATP－bidnding cassette tiansporters，ABC transporters，ABC 转 运体）参与了巨噬细胞的胆固醇逆向转运机制，将巨噬细胞和泡沫细胞内的胆固醇转移至血液或高密度脂蛋白中，经循环系统转运至肝脏进行分解代谢而抑制巨噬细胞泡沫化。胆固醇在单核细胞内聚集并使单核细胞泡沫化[2，3]。因此，ABCA1可能在AS的发生与发展过程中发挥着很关键的作用。为探讨ABCA1在巨噬细胞胆固醇流出到血液或转移到HDL机制中的作用，本实验采用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测ABCA1基因在AS患者中的表达与变化，进一步了解其在AS发病机制中所发挥的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取肇庆市第一人民医院2016年01月至2017年6月确诊为AS患者50例，作为AS组，该组患者均满足中国心脏病委员会对AS的诊断标准，其中男27例，女23例；年龄（55.4±7.2）岁；同期选取45例健康体检者作为对照组，对照组患者均冠脉造影正常，无冠心病和AS的相关临床症状，血清肌钙蛋白 （cTnI）无升高（＜0.1ng/ml）。 其中男 28 例，女 17 例；年龄（53.9±6.5）岁。

1.2 仪器与试剂 RNA提取试剂盒（invitrogen）、人单个核细胞分离液 （深圳市达科为生物工程有限公司）、逆转录试剂盒（中山大学达安基因公司）、PCR分析仪（ABI 7500）、PCR引物（上海生物工程股份有限公司）等。

1.3 方法

1.3.1 标本采集及单个核细胞分离 无菌操作采静脉血 2ml，用 EDTA·K2（或者枸橼酸钠）抗凝，使用密度梯度沉降法分离单个核细胞，用等体积的0.9%的生理盐水稀释全血，在离心管中加入一定体积的分离液，将稀释后的血样平铺到分离液上方，保持两界面清晰。分离液、全血、生理盐水的体积为 1：1：1；626×g，离心 20min（水平离心），吸取白细胞层（从上而下的第二层），-80℃冰冻保存。

1.3.2 制备单个核细胞总的RNA 取制备好的匀浆单个核细胞室温解冻，加入0.25ml氯仿，剧烈震动 20s， 室温静置 3min；4℃、12000×g 离心 15min，移上层液体至新EP管，加0.5ml异丙醇，充分震荡混匀后室温静置 15min；4℃、12000×g离心 10min弃上清液，保留底部沉淀；加入无水乙醇0.5ml洗涤沉淀，4℃、7500×g离心 5min，弃上清液，再重复洗涤沉淀一次，56℃干燥5min；加入20μl去离子水溶解RNA，60℃、孵育10min。紫外分光光度仪检测提取的RNA浓度，-80℃下冰冻保存。

1.3.3 引物的来源 根据在Pubmed中查到ABCA1基因的GenBank序列，同时遵循引物设计原则设计反应的引物，由上海生物工程公司合成，见表1。

表1 引物的设计

1.3.4 RT-PCR检测ABCA1 mRNA表达 以RNA为模板，使用中山大学达安基因公司RT-PCR反应试剂盒进行RT-PCR反应。扩增条件为50℃30min，94℃ 2min， 然 后 94℃ 30s，56℃ 30s，72℃2min，30个循环。RT-PCR扩增完成后取3μl RTPCR产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳，恒压80V电泳30min，紫外透射仪下观看结果并拍照，图片经图像分析软件Band Scan进行光密度值扫描与分析，根据分析结果计算出各泳道ABCA1与内参照β-actin光密度之比作为ABCA1相对含量值。

1.4 统计学方法 采用SPSS 15.0统计软件进行分析。两组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血单个核细胞ABCA1 mRNA的表达 AS患者PBMC中mRNA表达显著高于对照组 （P＜0.05），差异有统计学意义。见表2、图1。

表2 PBMC ABCA1 mRNA表达检测结果（±s）

表2 PBMC ABCA1 mRNA表达检测结果（±s）

检测项目 AS 健康对照组ABCA1/β-actin（mRNA） 0.425±0.086 0.253±0.024

图1外周血单个核细胞ABCA1基因表达

3 讨论

血液中胆固醇水平增高，进而在单核细胞内积累并泡沫化是导致动脉粥样硬化和血管炎症的重要原因[4]。细胞内胆固醇流出是控制泡沫细胞形成的重要机制，而ABC转运体在该机制的正常运行中发挥关键作用[5，6]。胆固醇从细胞中流出，可转运至HDL和ApoA1进入血循环至肝脏进行代谢，预防动脉粥样硬化的发生。对实验小鼠ABCA1基因进行敲除和实施高脂喂养，基因敲除小鼠均发生动脉粥样硬化，而且硬化斑块面积更大且浸润损伤更严重[7，8]。本研究采用RT-PCR比较AS患者和健康者单个核细胞中ABCA1 mRNA水平的差异，发现AS患者ABCA1 mRNA基因表达明显升高，表明ABCA1可能参与了AS发病机制，是AS潜在的预防或治疗靶点[9，10]，综上所述，深入研究胆固醇转运体ABCA1基因表达会对As的早期诊断与治疗提供依据，对As的疾病监测提供依据。