不确定性空瓶饮水刺激法和束缚应激法建立小鼠焦虑模型及比较

朱明好，蒋 宁，周文霞

（1.南京中医药大学研究生学院，江苏南京 210023；2.军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所，北京 100850；3.抗毒药物与毒理学国家重点实验室，北京 100850）

应激是机体在各种内外环境因素及社会、心理因素刺激时所出现的全身非特异性适应反应。应激对维持机体生命活动具有极其重要的意义，但持续而严重的应激会对机体产生负面影响，成为许多疾病的重要病因和诱因[1]。当今社会竞争激烈，生活节奏快，来自工作和生活的负担加重，人们所承受的压力与挑战（应激因素）逐渐增加。近年来，伴随着军事任务的日益复杂和军事作业环境的不断变迁，军人承受着越来越强烈、越来越复杂的生理和心理应激负荷，会诱发焦虑和抑郁等心理问题。目前对应激导致的焦虑症的研究已成为医学关注的热点，而一种客观、规范、重复性好的动物模型是研究的重要基础，对深入了解应激导致焦虑的发病机制及药物研发具有重要意义。慢性应激是焦虑抑郁等情绪疾病的重要发病因素之一，也是建立情绪类疾病动物模型的常用方法。目前对于焦虑动物模型的建立主要采用慢性应激法，按照应激源的性质大致可分为躯体应激、心理应激和综合应激3类。其中束缚应激和空瓶饮水刺激模型属于心理应激模型，并能够较好地模拟军事应激中狭小空间和缺水环境应激状态。因此，本研究拟通过建立束缚应激小鼠模型和不确定性空瓶饮水刺激小鼠模型，观察不同应激方法对小鼠产生焦虑样行为的影响，并对其机制进行初步探讨，旨在寻找一种合适的焦虑动物应激模型用于后续药物研究。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂和仪器

SPF级C57BL/6J小鼠，雄性，体质量20～24 g，购自北京斯贝福生物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2016-0002。饲养于军事科学院军事医学研究院实验动物中心，适应性饲养1周，自由摄食饮水，每日光照/黑暗各12 h。动物实验室环境温度24～26℃，相对湿度40%～60%。

磷酸盐缓冲液（PBS）（美国Gibco公司）；蛋白酶抑制剂（北京普利莱基因技术有限公司）；小鼠皮质酮（corticosterone，CORT）和5-羟色胺（serotonin，5-HT）ELISA试剂盒（北京成志科为生物科技有限公司）。

Anymaze动物视频分析系统、自主活动箱尺寸为（30 cm×30 cm×30 cm）、旷场装置尺寸为（50 cm×50 cm×40 cm）和高架十字迷宫装置中央区（5 cm×5 cm），开放臂（35 cm×5 cm），闭合臂（35 cm×5 cm），高架十字迷宫距离地面76 cm（上海欣软信息科技有限公司）；Milli-Q Biocel 纯水机（美国MilliPORE公司）；高速低温冷冻离心机（德国Heraus 公司）；EnSpire多功能酶标仪（美国PerkinElmer公司）；电热恒温培养箱（上海市跃进农场医疗器械厂）；超声波细胞粉碎机（宁波新芝科器研究所）。

1.2 自主活动性筛查

应激前，首先进行自主活动实验对受试小鼠的自主活动性进行检测。经适应性饲养后的小鼠，提前放入行为学房间适应30 min，测试前在自主活动箱中适应2 min，再用Anymaze 软件记录其活动20 min的运动总距离。将每只小鼠的运动总距离作为其活动性的主要指标，按照95%置信区间剔除自主活动过多或过少的小鼠，以利于开展后续的行为学实验。

1.3 不确定性空瓶饮水刺激模型的建立[2]

自主活动性正常的小鼠按体质量随机分为自由饮水组、定时饮水组、生理应激组和空瓶刺激组，每组8 只。为排除小鼠之间的相互影响，除自由饮水组（全天自由进食饮水）外，其余各组小鼠均单笼饲养，并进行喂水训练7 d，每天早晚固定2 个时间段给小鼠饮水10 min，其余时间撤掉水瓶不给水。训练7 d 后开始应激实验，定时饮水组小鼠每天固定2个时间点、间隔12 h，每次饮水10 min；在相同的时间点，生理应激组小鼠每天确保1次饮水10 min，另一次既不给水也不给空瓶；空瓶刺激组小鼠每天饮水时间随机给予1 次或2 次空瓶进行刺激，共计饮水12次，空瓶16次，以此来排除生理性缺水对小鼠的影响，实验持续14 d。整个过程中，所有动物自由进食。实验当天为第1天，实验前测基础体质量。然后，分别于第7和14天测量小鼠体质量。

1.4 束缚应激模型的建立

自主活动性正常的小鼠按体质量随机分为正常对照组和束缚应激组，每组8只。次日进行应激实验，于每天早上9∶00开始将小鼠头朝离心管的底部束缚在管内，将离心管水平固定在桌面上，第1天束缚2 h，随后每天束缚时间延长2 h，直至每天8 h，连续21 d。观察束缚应激小鼠在束缚7，14和21 d后体质量的变化。

1.5 旷场实验

空瓶刺激模型小鼠于空瓶刺激14 d后，束缚应激模型小鼠于束缚应激14 和21 d 后进行旷场实验。实验前，将小鼠放入光线昏暗和安静的行为学房间内适应30 min，然后将小鼠放入旷场实验箱中适应30 s，记录小鼠在旷场箱内的旷场内运动总距离和旷场中央区停留时间，总时间为5 min[3]。

1.6 高架十字迷宫实验

空瓶刺激模型小鼠于空瓶刺激14 d后，束缚应激模型小鼠于束缚应激14和21 d后进行高架十字迷宫实验。实验前将小鼠放入光线昏暗和安静的行为学房间内适应30 min，然后将小鼠面朝开放臂放入高架十字迷宫，记录小鼠在高架十字迷宫内的开放臂内停留时间和进入开放臂次数，总时间为5 min[4]。

1.7 血浆和脑组织样本的收集

束缚应激行为学测试结束后处死小鼠，取血至预先装有100 μL（4%EDTA·Na2）的EP 管中。以3000×g 4℃下离心15 min 后取上清，并分装于EP管中，保存至-80℃冰箱中待测。冰盒上分离小鼠双侧海马，置液氮中保存待用。

1.8 酶联免疫吸附实验

采用ELISA 检测束缚应激21 d 小鼠血浆CORT 水平和海马组织中5-HT含量。称重后，将海马组织剪碎放入EP管中，按1∶10的质量体积比加入PBS（含蛋白酶抑制剂），于冰上充分研磨，进行超声破碎。最后将匀浆液于5000×g 4℃下离心10 min，取上清液检测。实验方法按照试剂盒说明书进行操作。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 不同应激对小鼠体质量的影响

空瓶刺激：与自由饮水组相比，定时饮水组小鼠体质量无明显变化，空瓶刺激组和生理应激组小鼠均显著下降（P<0.01）；与定时饮水组相比，空瓶刺激组和生理应激组小鼠体质量在空瓶刺激7 d后显著下降（P<0.05），在空瓶刺激14 d 无明显变化（图1）。

Fig.1 Effect of empty bottle stimulation on changes of body mass in mice. The mice in the freely drinking water group were given free access to drinking water throughout the day. The mice in regular drinking water group were given free water for 2 periods per day. The regular drinking water group mice were given water for 10 min at 2 fixed moments with 12 h interval every day. At the same time，physiological stress group mice were guaranteed to drink water for 10 min once a day，and at another time they were given neither water nor empty bottles. The empty bottle stimulation group mice were given empty bottle stimulation randomly once or twice every day.Drinking water was provided 12 times and empty bottle stimulation was conducted 16 times；the experiment lasted for 14 d.x±s，n=8. ＊＊P<0.01，compared with freely drinking water group；#P<0.05，compared with regular drinking water group.

束缚应激：与正常对照组相比，束缚应激组小鼠在束缚应激14 和21 d 后体质量均显著下降（P<0.05）（图2）。

Fig.2 Effect of restraint stress on changes of body mass in mice. The normal control group mice were raised normally. The mice in the restraint stress group were restrained for 2 h on the first day，and then the daily restraint intensity was extended for 2 h until 8 h every day for 21 d. x±s，n=8. ＊P<0.05，compared with normal control group.

2.2 不同应激对小鼠自主活动和探索行为的影响

空瓶刺激：与自由饮水组相比，定时饮水组小鼠在旷场中运动总距离和在旷场中央区停留时间均无明显变化，空瓶刺激组和生理应激组小鼠在旷场中运动总距离显著增加（P<0.01）。与定时饮水组相比，空瓶刺激组和生理应激组小鼠在旷场中运动总距离和旷场中央区停留时间均无明显变化（图3）。

Fig.3 Effect of empty bottle stimulation on autonomic activity and exploration behavior in mice. See Fig.1 for the mouse treatment. The total distance（A）and time in center（B）of the open field behavior were measured after empty bottle stimulation 14 d±s，n=8. ＊＊P<0.01，compared with freely drinking water group.

束缚应激：与正常对照组相比，束缚应激组小鼠在旷场中运动总距离和旷场中央区停留时间均无明显变化（图4）。

2.3 不同应激对小鼠焦虑样行为的影响

空瓶刺激：与自由饮水组相比，定时饮水组小鼠在高架十字迷宫开放臂内停留时间显著减少（P<0.05），进入开放臂的次数有下降趋势；空瓶刺激组和生理应激组小鼠进入开放臂的次数和在开放臂内停留时间无明显变化。与定时饮水组相比，空瓶刺激组和生理应激组小鼠进入开放臂的次数和在开放臂内停留时间无明显变化（图5）。提示单纯性缺水对定时饮水组小鼠的行为产生明显影响。

束缚应激：与正常对照组相比，束缚应激14 d小鼠进入高架十字迷宫开放臂的次数和在开放臂内停留时间均显著减少（P<0.01，P<0.05）；而束缚应激21 d 小鼠进入高架十字迷宫开放臂的次数和在开放臂内停留时间无明显变化（图6）。提示束缚应激14 d可诱发小鼠产生焦虑样行为，而束缚应激21 d小鼠焦虑样行为消失。

Fig.4 Effect of restraint stress on autonomic activity and exploration behavior in mice. See Fig.2 for the mouse treatment. The total distance（A）and time in center（B）of the open field behavior were measured after restraint stress 14 and 21 d.s，n=8.

Fig.5 Effect of empty bottle stimulation on anxiety-like behavior in mice. See Fig.1 for the mouse treatment. The time in open arm（A）and open arm entrance（B）of the elevated plus maze behavior were measured after empty bottle stimulation 14 d.，n=8.＊＊P<0.01，compared with freely drinking water group.

2.4 束缚应激对小鼠血浆皮质酮水平和海马组织5-羟色胺含量的影响

与正常对照组相比，束缚应激21 d 小鼠血浆CORT 水平显著降低（P<0.01），海马组织中5-HT含量亦显著降低（P<0.05）（图7）。

Fig.6 Effect of restraint stress on anxiety-like behavior in mice. See Fig.2 for the mouse treatment. The time in open arm and open arm entrance of the elevated plus maze behavior were measured after restraint stress 14（A，B）and 21 d（C，D）.x±s，n=8.＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with the normal control group.

Fig.7 Content of corticosterone（CORT）in plasma（A）and serotonin（5-HT）in hippocampus tissue（B）of mice after restraint stress 21 d. See Fig.2 for the mouse treatmentn=8. ＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with the normal control group.

3 讨论

慢性应激负荷是现代社会中影响人类健康水平和生存质量的重要因素，也是导致人类多种重大致死性疾病的重要病因和诱因。慢性应激可引起生物体内环境紊乱，从而导致焦虑恐惧和行为异常。由于极端恶劣生存环境、精神超负荷紧张及高强度军事作业等军事因素，机体面临着更加复杂而强度更大的应激负荷，对机体所造成的损伤也多种多样。军事应激最常遇到的问题就是狭小空间和缺水环境，束缚应激动物模型和不确定性空瓶饮水刺激动物模型能够很好地模拟上述2 种应激状态。束缚应激模型主要用来模拟狭小空间障碍，以诱发产生焦虑和抑郁等情绪，被广泛应用于精神疾病研究[5]。不确定性空瓶饮水刺激模型是一种慢性情绪应激动物模型[2]，主要以攻击行为、探究行为及修饰行为来考察动物在应激条件下的情绪反应。上述2种模型易于操作，所需设备简单，且对动物身体伤害相对较小，更符合实验动物3R 原则，即减少、替代和优化原则。因此，本研究采用不确定性空瓶饮水刺激和束缚应激两种应激方法建立小鼠模型，通过分析比较上述2种应激方法对小鼠焦虑样行为的影响，寻求一种能够模拟军事应激、稳定且易于操作的小鼠焦虑模型。

目前不确定性空瓶饮水刺激模型的相关文献共检索出31篇，均以大鼠作为研究对象。为便于药效学评价，本研究选用C57BL/6小鼠进行空瓶刺激模型条件探索，此种小鼠对应激较为敏感，易于操作，被广泛应用于行为学实验中[6-7]。本研究发现，空瓶刺激组和生理应激组小鼠体质量均显著下降，表明生理性缺水能够对小鼠机体产生影响。束缚应激模型连续束缚14 和21 d，小鼠体质量显著降低，表现出心理应激对机体的直接影响，这与临床研究发现焦虑症患者体质量下降相符。

动物焦虑行为学评价方法主要基于动物对新环境既恐惧又欲探究的矛盾心理冲突[8]。旷场和高架十字迷宫实验是国际公认的、经典的检测焦虑情绪的行为学方法，是评价焦虑模型的金标准[9-10]，旷场实验利用动物畏惧空旷场地的天性及面对新事物又产生的好奇心去探究新场所，焦虑水平高的动物由于对陌生环境的恐惧，主要在边缘区域活动，而在中央区域活动较少[11]。本研究结果显示，束缚应激14 d模型小鼠在中央区的停留时间明显减少，提示模型小鼠可能出现焦虑样行为，待通过高架十字迷宫实验进行验证。空瓶刺激组小鼠较定时饮水组在旷场实验中的行为表现无明显变化，提示空瓶刺激14 d小鼠未出现焦虑样行为。

高架十字迷宫实验利用动物对新异环境的探究特性和对高悬开敞臂的恐惧心理，形成矛盾冲突，以考察动物的焦虑状态。由于开臂和外界相通，对动物具有一定的新奇性同时又具有一定的威胁性，焦虑的动物在开放臂内停留时间和进入开放臂的次数会明显降低。本研究结果表明，每天束缚2～8 h，连续束缚14 d可诱发小鼠产生焦虑样行为，而束缚应激延长至21 d 小鼠焦虑样行为消失。空瓶刺激组小鼠较定时饮水组在高架十字迷宫实验中的行为表现无明显变化，提示空瓶刺激14 d小鼠未出现焦虑样行为。但较自由饮水组比较，定时饮水组小鼠在开放臂停留时间显著降低，提示缺水和单笼饲养对定时饮水组小鼠行为产生明显影响。目前文献中空瓶刺激模型均采用大鼠，定时饮水组大鼠较自由饮水组无明显生理和行为学变化，且生理应激组大鼠较定时饮水组也无明显生理和行为学变化，从而排除了单纯性缺水对大鼠机体的影响[12]。因此，本研究提示大鼠和小鼠虽均为啮齿类动物，但对水的需求存在明显差别，缺水可对小鼠机体产生较大影响，提示小鼠对水的需求更强烈，可能不适用于空瓶刺激法建立焦虑模型。

通过对以上2种小鼠焦虑模型的建立及行为学评价，本研究发现，不确定性空瓶饮水刺激法建立小鼠焦虑模型不可控因素较多，如生理性缺水和单笼饲养对小鼠的行为可产生明显影响，动物品系的不同会造成实验结果的差异。因此采用小鼠建立该模型不够稳定。束缚应激14 d可诱发小鼠产生焦虑样行为，此法较不确定性空瓶饮水刺激操作更为简单，条件可控，稳定性较好，更适用于建立小鼠焦虑模型。

应激反应的中枢效应主要发生在下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamus-pituitary-adrenal，HPA）轴，应激会导致HPA轴功能紊乱，糖皮质激素皮质醇分泌异常，HPA 轴与神经内分泌网络密切相关，参与负反馈调节，对维持机体内环境起重要作用[13]。心理学理论认为，紧张生活事件可影响神经、内分泌和免疫系统，它们之间存在着复杂的相互联系。5-HT属于单胺类神经递质，参与机体神经、体温、疼痛和情绪等多方面的调节。5-HT 的代谢异常目前被认为是长期慢性应激反应的重要结果，慢性应激相关疾病抑郁症的主要病因之一就是5-HT 代谢异常。动物实验发现，5-HT 参与HPA 轴的激活与反馈调节，5-HT功能紊乱会导致情绪失控和海马神经元损伤和死亡，进而导致学习记忆能力下降[14]。本研究发现，束缚应激21 d小鼠血浆CORT含量和海马组织中5-HT含量显著降低，提示长时间束缚应激可导致小鼠HPA轴功能紊乱和脑内5-HT代谢异常。

综上所述，束缚应激14 d可成功建立小鼠焦虑模型，其机制可能与HPA 轴功能紊乱和5-HT 代谢异常相关。不确定性空瓶饮水刺激法建立小鼠焦虑模型的稳定性和敏感性欠佳，不可控因素较多，刺激14 d未成功建立小鼠焦虑模型，该模型建立条件有待于进一步探索。