多柔比星对大鼠离体胸主动脉和颈总动脉血管环的舒张作用及其机制

李荣巧，李发珍，谢 童，范彦英，杨彩红

（山西医科大学药理学教研室，山西太原 030001）

多柔比星（doxorubicin，DOX）是高效广谱的蒽醌类抗肿瘤抗生素，被广泛应用于多种血液系统肿瘤和实体肿瘤，如白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌和胃癌等[1]，但其发挥抗肿瘤作用的同时会引发一系列的毒副反应，如脱发、胃肠道反应、心脏毒性和骨髓抑制，其中危害较为严重的是其心血管毒性。据统计，接受DOX 或其衍生物治疗的患者中，大约10%患者在化疗停止后10 年内会相继出现心脏并发症[2]，大大降低了癌症患者的远期生活质量及存活率。目前，DOX相关心血管毒性机制尚未完全清楚[3]。相关研究发现，DOX剂量依赖性慢性心肌病有显著的血压过低症状[4]。为探究其血压降低的症状是否与药物直接作用于血管相关，本研究拟探讨DOX 对大鼠胸主动脉和颈总动脉血管环的作用及其可能机制，旨在丰富其药理毒理学资料，减轻其毒副反应，提高癌症患者的远期生活质量和生存率。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂和仪器

DOX（北京索莱宝科技有限公司）（批号427B023）；去氧肾上腺素（苯肾上腺素，phenylephrine，PE）、乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）、左旋硝基精氨酸甲酯（NG-nitro-L-arginine methyl ester，LNAME）、吲哚美辛（indometacin，Indo）、四乙铵（tetraethylammonium，TEA）、4-氨基吡啶（4-aminopyridine，4-AP）、氯化钡（BaCl2）和格列本脲（glibenclamide，Gli）均购自美国Sigma；普萘洛尔（propranolol，产品批号为1802001）购自天津力生制药股份有限公司；生理盐溶液（physiological saline solution，PSS）成 分（mmol·L-1）：NaCl 144，KCl 5.8，CaCl22.5，MgCl21.2，葡萄糖11.1，HEPES 5；其余试剂均为国产分析纯。生物信号采集分析系统（型号PowerLab 8/30）及张力记录仪（型号MLT0201/D）购自澳大利亚埃德公司；雷磁pH计（型号PHS-3E）购自上海仪电科学仪器股份有限公司；数字式超级恒温浴锅（型号HSS-1B）购自成都仪器厂。

1.2 动物和大鼠胸主动脉和颈总动脉血管环的制备及平衡[5-6]

SPF 级别SD 雄性大鼠，体质量250～300 g，山西医科大学实验动物中心提供，许可证号为SCXK（晋）2009-0001。将SD大鼠处死后，迅速取出其胸主动脉及左右颈总动脉，置于充有纯氧的4℃PSS液中，小心将其周围结缔组织剔除，剪3～4 mm 长的血管环为内皮完整血管环，采用自制棉棒来回轻轻摩擦2次可得去内皮血管环。将血管环管腔通过1个三角形挂钩和1个L型细钢丝贯穿，水平悬挂于10 mL 恒温浴槽内，下方固定，上方通过细钢丝与张力换能器相连，用PowerLab 数据采集分析系统检测血管环张力变化。恒温浴槽内不断通入100% O2，加入5 mL 37℃PSS 液，并保持温度在36.8～37.2℃。主动脉和颈总动脉环悬挂于浴槽，分别调节前负荷为2 和1 g，稳定约60 min，期间每隔15 min换PSS液1次。

KCl 60 mmol·L-1重复刺激2次，2次KCl收缩幅度差值<10%证明血管活性良好。PE 1 μmol·L-1收缩达稳态时加入ACh 10 μmol·L-1，若胸主动脉舒张程度＞70%，说明内皮完整性良好，为内皮完整组。若其舒张程度<10%，则认为内皮去除完全，为去内皮组。若颈总动脉舒张程度＞30%，可认为血管组织结构完整，可用于药物干预实验。

1.3 基础状态及KCl预收缩的胸主动脉和颈总动脉血管环张力测定

采用内皮完整胸主动脉及颈总动脉血管环，分别分为溶剂对照组和DOX给药组，在血管环基础状态下及KCl 60 mmol·L-1预收缩稳定后每10 min累积加入DOX，使其终浓度递增为1，3，10，30和100 μmol·L-1（以下累加DOX 均同此法）。溶剂对照组加入等体积生理盐水，以排除渗透压对血管环张力的影响。DOX 舒张血管百分比（%）=（KCI 诱发的血管环最大的收缩张力-给DOX 后血管环张力）/（KCI 诱发的血管环最大的收缩张力-血管环基础张力）×100%。

1.4 PE 预收缩的胸主动脉和颈总动脉血管环张力测定

采用内皮完整胸主动脉、颈总动脉和去内皮胸主动脉，PE 1 μmol·L-1预收缩稳定后，给药组加入累积浓度DOX（加药方法同1.3），溶剂对照组加入等体积溶剂，累积浓度DOX 舒张血管的百分比（%）=（PE 诱发的血管环最大收缩张力-给DOX 后血管环张力）/（PE 诱发的血管环最大收缩张力-血管环基础张力）×100%。

1.5 L-NAME、吲哚美辛和普萘洛尔预处理后PE预收缩的胸主动脉血管环张力测定

L-NAME 0.1 mmol·L-1、Indo 0.01 mol·L-1和普萘洛尔0.01 mol·L-1孵育内皮完整胸主动脉血管环30 min，PE 1 μmol·L-1预收缩达稳态后加入累积浓度DOX（加药方法同1.3），DOX组只加累积浓度DOX，求各组累积浓度DOX舒张血管的百分比，计算方法同1.4。

1.6 钾通道阻滞剂预处理后PE预收缩的胸主动脉血管环张力测定

钾离子通道阻滞剂BaCl21 mmol·L-1、TEA 1 mmol·L-1、Gli 0.01 mmol·L-1和4-AP 1 mmol·L-1孵育内皮完整胸主动血管脉环30 min，之后实验方法同1.5，求得各组累积浓度DOX 舒张血管的百分比。

1.7 DOX预处理后无钙液中PE预收缩的胸主动脉血管环张力测定[7-8]

待胸主动脉血管环稳定后，用含EGTA 的无钙PSS 液洗脱血管环，以此络合细胞外钙，使细胞外液达到一种无钙的理想状态，20 min 后用不含EGTA 的无钙PSS 液替换浴槽内液体，排除EGTA对复钙后血管收缩反应的影响。15 min后加入PE 1 μmol·L-1，记录胸主动脉血管环的张力变化，此时的血管收缩反应是依赖于细胞内钙的释放；待血管环收缩稳定后，累积加入CaCl2（0.03，0.1，0.3，1 和3 mmol·L-1），此时血管的收缩是依赖于细胞外钙的内流。将2次血管收缩最大张力值作为给药前对照值，当血管环收缩达平台后，用含EGTA 的无钙PSS液洗脱血管环，20 min后用不含EGTA的无钙PSS 液替换浴槽内液体，分别预孵DOX 1，10 和100 μmol·L-1，对照组加入等体积溶剂，30 min后加入PE，血管收缩达平台期后复钙，比较预孵DOX前后PE引起的血管收缩幅度及复钙后血管收缩幅度变化，观察DOX对内钙释放和外钙内流引起胸主动脉血管环收缩的影响。

1.8 统计学分析

应用SPSS 20.0 及Graph Pad Prism 5软件进行统计学处理，实验数据结果以表示，两组间比较进行t 检验分析，P<0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DOX 对大鼠离体胸主动脉和颈总动脉血管环基础张力的影响

实验结果表明，累积浓度DOX对基础状态下的大鼠离体胸主动脉血管环（图1A）和颈总动脉血管环（图1B）无明显的收缩和舒张作用。

Fig.1 Effect of doxorubicin（DOX）on basic tension of rat thoracic aorta（A）and carotid artery（B）.s，n=6.There was no significant difference between DOX and vehicle control groups.

2.2 DOX 对KCl 预收缩的大鼠离体胸主动脉和颈总动脉血管环的影响

累积浓度DOX 对KCl 预收缩的大鼠离体胸主动脉（图2A）和颈总动脉血管环（图2B）无明显的收缩和舒张作用。

2.3 DOX对PE预收缩的颈总动脉血管环张力影响

累积浓度DOX 对PE 预收缩的内皮完整颈总动脉血管环有浓度依赖性的舒张作用，半舒张浓度（RC50）为30.47 μmol·L-1，最大累积浓度DOX 对血管环的舒张百分比为（72±8）%，与溶剂对照组相比差异有统计学意义（P<0.01，图3）。

Fig.3 Effect of DOX on rat carotid artery precontracted by phenylephrine（PE）1μmol·L-1. A：typical original tracting of endothelium-intact（End+）carotid artery after application of PE followed by cumulative application of DOX. B：relaxation was expressed as percentages of maximal contraction induced by PE. Relaxation rate（%）=（the maximal tension induced by PE-vascular tension after DOX）（/the maximal tension induced by PE-vascular basal tension）×100%.x±s，n=6.＊＊P<0.01，compared with vehicle control group.

2.4 DOX对PE预收缩的内皮完整和去内皮胸主动脉血管环的影响

累积浓度DOX 对PE 预收缩的内皮完整（图4A、C）和去内皮大鼠离体胸主动脉血管环（图4B、D）均有浓度依赖性的舒张作用（r内皮完整=0.95，P<0.01；r去内皮=0.97，P<0.01）。最大累积浓度DOX 对内皮完整及去内皮胸主动脉血管环的舒张率分别为（47±3）%和（27±4）%，内皮完整组与去内皮组相比差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01，图4E）。

Fig.2 Effect of DOX on rat thoracic aorta（A）or carotid artery（B）precontracted by KCl 60 mmol·L-1 for 10 min. When vascular tension reached a stable state，DOX and saline were cumulatively added into organ bath.x±s，n=6.There was no significant difference between DOX and vehicle control groups.

Fig.4 Effect of DOX on endothelium-intact（End+）thoracic aorta（A，C）and endothelium-denuded（End-）thoracic aorta（B，D）precontracted by PE 1 μmol·L-1. A and B：typical original tracting of End+ thoracic aorta and Endthoracic aorta after application of PE followed by cumulative application of DOX，respectively. C，D and E：the quantitative results of A and B.，n= 6. ＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with corresponding vehicle control group；#P< 0.05，##P<0.01，compared with End-group.

2.5 L-NAME、吲哚美辛和普萘洛尔对PE预收缩下DOX舒血管作用的影响

PE 预收缩下，L-NAME 可明显减弱DOX 的舒血管作用（P<0.01，图5），说明DOX 的血管舒张效应可能是通过内皮途径介导；普萘洛尔和环氧化酶抑制剂Indo 对DOX 的血管舒张效应作用不明显（图5），表明DOX 的血管舒张作用可能与β 受体及前列环素无关。

Fig.5 Effect of NG-nitro-L-arginine methyl ester（L-NAME），indomethacin（lndo）and propranolol on DOX-mediated vasodilating effect on isolated thoracic aorta precontracted by PE 1μmol·L- 1. Thoracic aorta rings were incubated with L-NAME，Indo and propranolol for 30 min，then precontracted by PE. DOX was cumulatively added into organ bath.，n=6.＊＊P<0.01，compared with DOX group.

2.6 钾通道阻断剂对PE预收缩下DOX舒血管作用的影响

实验结果表明（图6），电压依赖性钾通道（KV）抑制剂4-AP、特异性钙敏感性钾通道（KCa）抑制剂TEA和内向整流型钾通道（KIR）抑制剂BaCl2可抑制PE 预收缩下DOX 引起的血管舒张（P<0.05，P<0.01），而ATP 敏感性钾通道（KATP）抑制剂Gli 无此作用。说明DOX 对大鼠离体胸主动脉血管环的血管舒张效应可能与Kv，KCa和KIR开放有关，而与KATP无关。

Fig.6 Effect of BaCl2，tetraethylammonium（TEA），glibenclamide（Gli）and 4-AP on DOX-mediated vasodilating effect on isolated thoracic aorta precontracted by PE 1μmol·L-1. Thoracic aorta rings were incubated with BaCl2，TEA，Gli and 4-AP for 30 min，then precontracted by PE. DOX was cumulatively added into organ baths，n=6.＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with DOX group.

2.7 DOX 对依赖于内钙释放和外钙内流引起的血管收缩作用的影响

如图7A，在无钙PSS液中，PE 1 μmol·L-1可引起胸主动脉血管环小幅度的收缩，复钙后进一步收缩。实验结果表明，预孵DOX 1，10和100 μmol·L-1可浓度依赖性地抑制PE在无钙液中引起的轻微血管收缩，收缩率分别为（55.5±3.1）%，（47.3±4.4）%和（37.2±2.0）%，与溶剂对照组（65.7±3.4）%相比，差异有统计学意义（P<0.01，图7B）。预孵DOX 1，10 和100 μmol·L-1亦可浓度依赖性地抑制复钙后的血管环收缩，使氯化钙收缩曲线右移（P<0.05，P<0.01，图7C）。

Fig.7 Effect of DOX on contraction of isolated thoracic aorta rings precontracted by PE 1 μmol·L-1 depending on intracellular calcium release and extracellular calcium influx. A：typical original tracting of the effects of giving prior DOX or not on PE-induced contractions. B：the second vasocontraction induced by PE was expressed as percentages of the first contraction induced by PE. C：the second vasocontraction induced by cumulative concentration of CaCl2 was expressed as percentages of the first maximal contraction induced by CaCl2. s，n=6.＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with vehicle control group.

3 讨论

本研究发现，DOX 对PE 预收缩的内皮完整胸主动脉和颈总动脉血管环均有浓度依赖性的舒张作用，去除胸主动脉内皮后，DOX 仍能部分舒张胸主动脉，但舒张作用减弱。因此，DOX 舒血管机制既有内皮依赖性又有非内皮依赖性。

一氧化氮（nitric oxide，NO）是在内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxidase，eNOS）的作用下由左旋精氨酸转化而成，可通过激活平滑肌细胞鸟苷酸环化酶，引起环鸟苷酸含量升高，使细胞内钙离子减少，进而介导血管平滑肌舒张[9]。本实验预先给予eNOS抑制剂L-NAME，DOX的舒血管作用被部分抑制，说明其内皮依赖性舒血管作用可能与内皮-NO-cGMP途径有关；前列环素是血管内皮细胞合成的另一血管舒张因子，可通过激活腺苷酸环化酶，使细胞内钙离子含量降低进而引起血管舒张[10]。本研究中环氧化酶抑制剂Indo对DOX舒血管作用无明显影响，而环氧化酶是合成前列环素的主要限速酶之一。由此推测，DOX的血管舒张作用与前列环素无关；另外，血管平滑肌细胞β肾上腺素能受体亦可使细胞内Ca2+含量减少，从而舒张血管。本研究中，β受体阻断剂普萘洛尔对DOX的血管舒张作用无影响，由此推测DOX的舒血管作用与β受体无关。

钾离子通道是一类血管平滑肌细胞膜上调节平滑肌张力的重要离子通道，它的开放可引起细胞膜超极化进而关闭电压门控性钙通道，外钙内流减少导致血管舒张[11]。血管平滑肌细胞有4种不同类型的钾通道[12]：①KV在血管平滑肌细胞广泛存在，参与调节血管张力及血管平滑肌细胞的静息电位；②KCa广泛存在于生物体内，在生理和病理条件下都有调节血管张力的作用；③KIR在多种细胞中均有表达，其调节血管张力作用目前尚不明确；④KATP可通过调节血管平滑肌细胞膜静息电位参与调节血管张力。阻断这些通道后，通过观察其对DOX舒血管作用的影响可初步判断DOX 舒血管机制是否与钾通道有关。实验结果发现，KV抑制剂4-AP、KCa抑制剂TEA和KIR抑制剂BaCl2减弱了PE预收缩下DOX 的血管舒张作用，而KATP抑制剂Gli 对其无影响，说明DOX的血管舒张效应可能与KV，KCa和KIR开放有关，与KATP无关。本研究仅对DOX舒血管机制与钾通道的相关性进行了初步研究，仍需进一步的验证与探讨。

血管平滑肌收缩依赖于细胞外钙内流，亦可依赖于细胞内储钙释放[13]。KCl可通过激活电压依赖性钙离子通道（voltage dependent calcium channel，VDCC）引起细胞外钙离子内流，进而导致血管收缩。本实验中，DOX对KCl预收缩下的大鼠胸主动脉和颈动脉血管环无作用，表明DOX可能不通过激活或抑制VDCC 而产生收缩或舒张血管的作用。PE 是α1肾上腺素能受体激动剂，一方面它可通过激动受体促进细胞外钙内流，另一方面，又可通过促进细胞内肌浆网钙离子释放，引起细胞内钙离子增多，共同促进血管收缩。本研究结果显示，DOX可明显抑制无钙液中PE 诱导的血管收缩并可使CaCl2量效曲线右移，通过抑制外钙内流及内钙释放发挥其舒血管作用。

综上所述，DOX对静息状态及KCl预收缩的大鼠离体胸主动脉和颈动脉血管环张力无明显影响，但可浓度依赖性地舒张PE预收缩的内皮完整胸主动脉和颈总动脉血管环，且其对去内皮胸主动脉环也有舒张作用，但弱于内皮完整组。DOX舒血管机制可能与内皮细胞NO/cGMP 途径、KV、KCa和KIR、内钙释放及外钙内流有关，与前列环素、血管平滑肌β受体和KATP无关。