根癌农杆菌D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因克隆、结构预测及原核表达

朱星星， 杨培周， 杜明睿， 吴 芸， 姜绍通

(合肥工业大学 食品与生物工程学院/安徽省农产品精深加工省级实验室， 安徽 合肥 230009)

作为一种自然界天然存在但含量极少的糖，D-阿洛酮糖属于一种新型低热量甜味剂，其甜度相当蔗糖的70%，能量仅为蔗糖的0.3%[1-2]，D-阿洛酮糖还具有特殊的生理活性，包括预防肥胖[2-3]、降血糖[3-4]、降血脂[5]、抗氧化[4]、保护神经[6]以及抑制癌细胞[7]等，因此，D-阿洛酮糖在降低糖吸收、调控身体机能以及抑制癌细胞等领域具有重要的应用价值，市场潜力广阔。

D-阿洛酮糖是D-果糖在C3位置的差向异构体，目前，主要采用化学合成和生物合成技术实现D-阿洛酮糖的生产。采用化学合成技术，钼酸盐在80～120 ℃能够将葡萄糖转化为D-阿洛酮糖[8]；生物合成主要是通过D-塔格糖差向异构家族酶催化生成D-阿洛酮糖，与化学方法相比较，生物催化合成更为环保，分离纯化难度更小。通过基因工程技术，催化产D-阿洛酮糖的D-塔格糖差向异构家族酶已在大肠杆菌[9]、枯草芽孢杆菌[10]和酿酒酵母[11]中实现高效表达，基因来源主要为梭状芽孢杆菌[12-13]，瘤胃球菌[9]，根癌土壤杆菌[14-15]，球形红菌[16]，密螺旋体属菌[17]等。在国内，江南大学采用通过D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因克隆、工程菌构建和发酵控制等技术，将D-果糖转化为D-阿洛酮糖[17-18]。目前，全球D-阿洛酮糖的主要生产商韩国希杰第一制糖株式会社、英国泰莱和日本松谷集团都采用生物方法，将D-果糖转化为D-阿洛酮糖。因此，构建可催化产D-阿洛酮糖的基因工程菌是实现D-阿洛酮糖产业化的重要途径。

本研究根据NCBI公布的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(DPEase)基因的全序列，设计引物，扩增DPEase基因，通过生物信息学软件分析基因序列，预测翻译后的蛋白质结构和性质；构建原核重组质粒，检测DPEase基因在E.coliBL21中诱导表达，为进一步构建DPEase基因工程菌提供材料。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105由唐晓凤博士馈赠，保存于合肥工业大学农产品精深加工实验室；E.coliDH5α、E.coliBL 21感受态细胞、FastPfuDNA聚合酶、pEASY-Blunt E1表达载体、氨苄青霉素、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)购自北京全式金生物公司；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒和SanPrep柱式DNA小量抽提试剂盒，生工(上海)公司；引物由生工(上海)公司合成。

1.2 仪器与设备

Nano- 100型分光光度计，杭州奥盛仪器公司；TC- 96型PCR仪，杭州博日公司；Universal Hood Ⅱ型全自动凝胶成像仪和蛋白电泳仪，美国Bio- Rad公司；EPS300 DNA型电泳仪和电泳槽，上海天能公司；E2695型高效液相色谱系统，美国Waters公司。

1.3 实验方法

1.3.1重组大肠杆菌的构建

根据NCBI数据库中公开的根癌农杆菌编码的DPEase基因 (KX098480.1)，设计引物，上游引物：5′- CAGAAAAGCGAAAGAGACACC -3′；下游引物：5′- TGAGGATATTATCGCAAATC -3′；以提取的基因组DNA为模板，PCR扩增DPEase基因，回收目的片段，将目的片段与pEASY-Blunt E1载体连接，转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒，测序，重组质粒转化E.coliBL21，通过抗性培养基筛选转化子，PCR鉴定拟转化子。

1.3.2生物信息学分析

采用NCBIBLAST比对核苷酸及氨基酸序列，通过NCBI在线ORF finder寻找基因编码框，利用Prot-Param在线软件分析蛋白质的理化性质，采用Signal P 4.1 Server预测蛋白信号肽，利用TMHMM 2.0 Server分析蛋白质的跨膜区，采用Predict Protein在线工具预测蛋白质二级结构，利用 Swiss-Model在线工具预测蛋白质三级结构。

1.3.3重组DPEase的诱导表达和分离纯化

重组E.coliBL21接种于200 mL含100 μg/mL氨苄的LB培养基中，37 ℃ 200 r/min振荡培养，过夜，然后加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，在温度16 ℃和摇床转速150 r/min的条件下培养32 h，诱导重组菌表达外源蛋白。在4 ℃下，8 000 r/min离心10 min，收集菌体，生理盐水洗涤3次，缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，pH=8)重悬；在冰浴条件下，超声(功率300 W，工作3 s，间歇5 s，90次)破碎细胞，12 000 r/min离心15 min收集上清液，获得粗酶液；用0.22 μm微孔滤膜过滤粗酶液，将粗酶液加到层析柱上，低浓度咪唑洗脱液洗脱杂蛋白质，高浓度咪唑洗脱液洗脱目的蛋白质，目的蛋白质放入10 kDa的超滤管中浓缩除杂，SDS-PAGE检测重组DPEase。

层析柱预处理是在4 ℃条件下，采用上样缓冲液(50 mmol/L Na2HPO4，50 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，pH=7.4)平衡Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow亲和层析柱。低浓度咪唑洗脱液为50 mmol/L Na2HPO4，50 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，50 mmol/L咪唑，pH=7.4。高浓度咪唑洗脱液为50 mmol/L Na2HPO4，50 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，pH=7.4。

1.3.4D-阿洛酮糖-3-差向异构酶活力测定

设置的5 mL催化反应体系中含有1 mL酶液、500 g/L D-果糖和50 mmol/L Tris-HCl(pH=8)，在55 ℃和150 r/min条件下保温10 min，采用高效液相色谱法测定D-阿洛酮糖的含量[19]，液相色谱柱为RezexTM RCM-monosaccharide Ca2+(Phenomenex IncTorrance, USA)，检测器为2410型示差检测器，流动相为超纯水。设置参数：柱温80 ℃，流速0.4 mL/min，进样量10 μL。单位酶活力定义为1 min生成1 μmol D-阿洛酮糖为一个酶活力单位，以U/mL表示。

2 结果与分析

2.1 重组大肠杆菌的构建结果

以提取的根癌农杆菌基因组DNA为模板，根据DPEase序列设计的引物进行扩增，电泳结果见图1。

泳道M 为marker，1为阴性对照，2～4为扩增产物。图1 根癌农杆菌DPEase基因的PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification of A. tumefaciens DPEase gene

由图1可知，电泳检测出一条约900 bp的目的片段，与预期大小一致。

目的片段与表达载体pEASY-Blunt E1连接，转化E.coliDH5α，通过抗性筛选，提取转化子质粒，测序验证正确，转化导入宿主菌E.coliBL21中，通过抗性固体培养基筛选转化子，采用DPEase引物PCR扩增转化子基因组，鉴定工程菌，见图2。

泳道M为marker，1～4为拟转化子扩增产物，5为阴性对照，6为阳性对照。图2 PCR鉴定DPEase E. coli BL21转化子Fig.2 PCR identification of DPEase transformants of E. coli BL21

由图2可知，被检测的转化子都能扩增出与目的基因预期一致的DNA条带，初步说明构建的表达质粒已转化入E.coliBL21细胞内。

2.2 生物信息学分析结果

2.2.1序列分析

对测定的DPEase序列进行开放阅读框分析，结果表明，该序列包含1个完整的开放阅读框，由870 bp核苷酸组成，编码289个氨基酸。通过在线同源性分析，该基因与NCBI的Genbank数据库中根癌农杆菌编码D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因 NCIM：2942(KX098480.1)的核苷酸序列相似性为99.43%。

2.2.2DPEase蛋白的理化性质分析

采用软件Prot Param预测DPEase的理化性质，结果显示，DPEase蛋白由289个氨基酸组成，其中含量最高是甘氨酸G，占11.07%，其次是丙氨酸A，占10.73%，最低的是谷氨酰胺Q和半胱氨酸C；带负电的残基(Asp+Glu)37个，带正电的残基(Arg+Lys)31个；其理论分子质量31 493.62，共由4 406个原子组成，分子式为C1 410H2 182N390O417S7，等电点PI为6；根据蛋白质的平均疏水性值判断蛋白质的疏水性，该蛋白为亲水性蛋白。

2.2.3信号肽和跨膜区的预测结果

通过Signal P 4.1 Server的人工神经网络算法对DPEase蛋白进行信号肽预测，结果如图3。

图3 Signal P- 4.1预测DPEase蛋白信号肽得分Fig.3 Prediction scores of DPEase signal peptide by Signal P- 4.1

由图3可知，Y得分最高分值(0.143)为第12位的组氨酸残基，S得分为0.107，DPEase基因所编码的蛋白无信号肽，为非分泌蛋白。

利用TMHMM 2.0 Server进行DPEase蛋白的跨膜区分析，结果见图4。

图4 基于TMHMM的后验概率跨膜区分析结果Fig.4 Analysis of transmembrane region based on TMHMM posterior probability

由图4可见，该蛋白质在膜内的概率仅为0.063 42，所编码的289个氨基酸从1到289全部在膜外；跨膜螺旋数为0，图中未出现矩形跨膜区。因此，该蛋白质位于细胞膜外，无跨膜区。

2.2.4DPEase蛋白的二级结构

Predict protein预测结果表明，DPEase蛋白含有13个α-螺旋和8个β-折叠，α-螺旋占38.41%，β-折叠47.06%，另外，14.53%的氨基酸处于无规则卷曲状态；非跨膜蛋白、α-螺旋跨膜蛋白和β-桶状跨膜蛋白的可能性依次为0.997 2、0.002 6和0.000 2，因此，DPEase属于非跨膜蛋白，预测结果与TMHMM 2.0 Server软件分析结果一致。

2.2.5DPEase蛋白的三级结构

根据Swiss-Model在线软件进行建模预测，采用D-阿洛酮糖-3-差向异构酶2hk1.1.A为模型建立DPEase蛋白的三级结构，结果见图5。

图5 DPEase蛋白的四聚体和单体结构Fig.5 Tetramer and monomer structure of DPEase

由图5可知，DPEase的氨基酸序列与2hk1.1.A模板的序列一致性为99.65%，建模的可信度较高。该DPEase的氨基酸序列在191位与模型有差异，此位点不属于活性结合位点；另外，I66、G67、G106、A107、W112、E150、L152、E156、D183、H186、H209、R215、E244和I257为D-果糖催化活性位点；E150、D183、H209和E244为Mn2+离子结合位点。

2.3 重组大肠杆菌的诱导表达结果

在16 ℃下，1 mmol /L IPTG 诱导重组菌E.coliBL21表达DPEase，结果见图6。

图6 IPTG 诱导E.coli BL21工程菌表达DPEase酶活力Fig.6 DPEase activities of E.coli BL21 engineered strain induced by IPTG

由图6可知，随着诱导时间增长，目的蛋白表达量增大，而当诱导24 h后，酶活增加缓慢，目的蛋白表达量在28 h时达到最大值0.32 g/L，酶活性最高为3.8 U/mL。

2.4 重组DPEase的分离纯化结果

通过Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow亲和层析柱，利用重组pEASY-Blunt E1-DPEase质粒带有的组氨酸标签和不同浓度的咪唑洗脱液，分离出目的蛋白，SDS-PAGE结果见图7。

图7 SDS-PAGE分析纯化的DPEaseFig.7 SDS-PAGE analysis of purified DPEase

由图7可知，纯化后的蛋白质为单一条带，分子质量约为33 kDa，根癌农杆菌DPEase基因能够在E.coliBL21宿主中表达。

3 结 论

本文通过生物信息学分析根癌农杆菌DPEase蛋白结构，实验结果与已报道的结论接近。在分子质量预测上，本研究和Park等[20]研究表明，根癌农杆菌DPEase分子质量为33 kDa，与软件Prot Param预测的理论分子质量31 493.62相近；在DPEase晶体结构上，已有研究表明，DPEase蛋白为四聚体结构，每个单体呈典型TIM桶状，由(β/α)8结构组成，每个单体含有13个α-螺旋和8个β-折叠[14]，与本研究通过生物信息学预测获得的结果相一致；在三级结构的活性位点分析方面，Kim等[14]通过定点突变研究表明，位点I66、A107、W112、E156和R215影响根癌农杆菌DPEase结合D-果糖的效率，H209影响Mn2+与底物结合[21]，本研究通过预测，获得相似的结论。本研究通过分子克隆和原核表达检测根癌农杆菌DPEase的性质，与已知报道接近[14，21]，研究表明，通过构建原核表达载体能够实现DPEase的高效表达，但其酶学性质以及在催化产D-阿洛酮糖等方面的应用还需进一步研究。