ScYLV和SrMV的PCR引物优化设计

王洪星 ，张雨良 ，罗志文 ，杨文君 ，刘志昕

（1.中国热带农业科学院热带生物技术研究所/农业部热带作物生物技术重点开放实验室，海口 571101；2.海南大学环境与植物保护学院，儋州571737）

聚合酶链式反应（PCR）是体外扩增DNA的一种技术，其能够在短时间内根据极微量的模板序列扩增出大量特异性DNA片断，扩增过程类似于核裂变。Mullis博士在1983年发明了该技术，PCR技术是现代分子生物学中最有价值的技术之一（David Clark，2005），随着科学技术的发展其又衍生出多种类型的相关技术，包括差异显示PCR、实时定量PCR、巢式PCR、多重PCR和不对称PCR等（萨姆布鲁克，2002）。

PCR方法的广泛应用及其相关技术的顺利进行均离不开PCR引物的合理设计。可以说，PCR引物的合理设计是任何PCR反应能否进行及其产物的特异性、产率高低的关键。目前许多计算机软件如Primer Premier 3.0，Primer Premier 5.0，Oligo 6.0等均可用于引物的设计。但由于软件自身存在的局限性，其设计的引物并无法满足实验者不同需要。目前最常用的是计算机辅助设计，即实验者根据PCR引物设计的原则并结合自己的经验人工设计引物，然后选择合适的软件分析引物的合理性。

1 材料和方法

1.1 实验材料及软件

实验用甘蔗样品采自海南两院甘蔗种植基地。 Trizol（Invitrongen），SYBR Green supermix（TaKaRa）、RTPCR试剂盒PrimeScript TM One-Step Ver.2.0购自宝生物工程（大连）有限公司，PCR产物回收试剂盒（上海生物工程有限公司），反转录酶、Taq酶及其它生物试剂均购自北京全式金生物科技有限公司，其它药品为国产分析纯。Primer Premier 5.0、Oligo6.0、DNAMAN等软件于http://www.bio-soft.net下载。

1.2 甘蔗总RNA提取和RT-PCR

从待检测甘蔗植株上取幼嫩组织，以TRIzol法（余爱丽，2004）得到较理想的RNA样品。提取的总RNA溶解于100μL dd H2O中，取4μL RNA溶液稀释200倍，采用UV-760紫外分光光度计测量260nm、280nm的OD值，计算OD260／280的比值并用1.2%的普通琼脂糖凝胶电泳在约5V/cm的电压下，快速电泳检测并照相。

以所提取的总RNA为模板，利用宝生物工程 （大连）有限公司SuperScript III反转录体系进行，PCR反应按全式金公司TaqDNA聚合酶操作说明进行，并优化反应程序。

1.3 PCR引物的设计与目的序列测序

1.3.1 普通PCR引物设计与目的序列测序 根据甘蔗黄叶病毒 （ScYLV）genebank相关基因系列 （登录号AF369923.1；AF369924.1；AF369925.1；AF369926.1；AF369927.1；AF369928.1；AF369929.1；AF141385.1；AF141385.1）、 高粱花叶病毒 （SrMV） 相关基因序列 （登录 号：NC_004035.1；DQ530434.1；U57358.2；AY648298.1）通过DNAMAN软件比对，找出保守序列，综合考虑引物设计的各项原则，运用DNAMAN、Primer Premier 5.0和Oligo6.0进行基因同源性分析和引物设计，使引物序列G+C含量介于45%～60%，引物长度介于18～25bp，目的片段介于400～1000 bp（见表1）。

对PCR的各引物浓度及反应的退火温度进行优化，筛选出不同病毒PCR反应体系的最佳反应模式。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳；切胶后用回收目的片段，克隆于pMD18-T载体，送上海生物工程公司测序。

1.3.2 多重PCR引物设计扩增 利用上述结果，结合考虑多重PCR引物设计的各项原则，运用Primer Premier 5.0和Oligo6.0进行引物验证，以挑选出一对特异引物（表1）。

1.3.3 实时定量PCR引物设计 综合考虑多重PCR引物设计的各项原则， 运用 Primer Premier 5.0、Oligo6.0和DNAMAN进行基因同源性分析和引物设计。对PCR的各引物浓度及反应的退火温度进行优化，筛选出PCR反应体系的最佳反应模式（表2）。切胶回收，测序；连接pMD18-T载体、转化、提取质粒，稀释10倍，利用SYBR Green I荧光染料法做标准曲线。

表2 用于实时定量PCR扩增的引物特征

1.4 带有酶切位点的引物设计与目的序列测序

根据ScYLV相关基因 （登录号AY23679.1、GU190159.1、HM640267、AF157029.1、AF369927.1、GU190159.1、AF157029.1、AM072750.1、AY236971.1、GU570006.1），综合考虑酶切位点引物设计的各项原则，运用Primer Premier 5.0、Oligo6.0和DNAMAN进行基因同源性分析和引物设计，设计出克隆Coat Protein（CP）基因和P0蛋白基因的引物（表3）。

对PCR的各引物浓度及反应的退火温度进行优化，筛选出不同基因片段PCR反应体系的最佳反应模式。切胶回收、双酶切，连接pMD18-T载体、转化、提取质粒，双酶切质粒，凝胶电泳，回收目的片段，再送检测序。

表3 用于扩增ScYLV相关序列的带酶切位点的引物特征

2 结果与分析

2.1 样本总RNA电泳结果

用TRIzol法分别从感病植株叶片中提取RNA，琼脂糖凝胶电泳显示各条带清晰，无明显的拖尾现象，RNA具有较好的完整性（图1）。

图1 Trizol法提取甘蔗病叶总RNA 1%琼脂糖凝胶电泳

2.2 PCR引物效果检测

2.2.1 普通PCR引物效果检测 所设计PCR引物扩增效率高、特异性好、电泳结果呈单一亮带，且各引物无特异性条带，引物设计成功。ScYLV和SrMV均见特异性反应条带，经测序，1～5的条带大小依次为：833、470、591、400、346 bp，与预期产物大小相同（图 2）。

图2 引物特异性试验

图3 多重RT-PCR特异性试验

2.2.2 多重PCR引物设计效果检测 特异性试验ScYLV和SrMV均见特异性反应条带，而且引物之间与模板之间也未产生明显的相互干扰，引物设计成功。经测序，序列大小分别为346和833bp，与预计产物大小相同（图3）。

2.2.3 实时定量PCR引物设计效果检测 试验以制备的ScYLV标准品 （浓度分别为 108、107、106、105、104、103、102、101）采用10倍浓度的梯度稀释。通过梯度稀释样本的设置，用扩增曲线达到域值时的反应循环数（Ct值）做回归曲线，结果如图4：可以得到较理想的标准曲线，线性关系良好 （R2=0.988），扩增效率为99.8%，引物设计成功，可以定量检测ScYLV。

图4 ScYLV荧光定量标准曲线

图5 PMD-19重组质粒的酶切图谱

2.3 带有酶切位点的引物设计效果检测

PCR产物经双酶切后的电泳结果 （图5）表明，所设计引物扩增效率高、特异性好，可用于后续试验。ScYLV CP、P0可以顺利克隆表达，经测序，条带大小分别为591 bp和771 bp，与预期产物大小相同，均成功连有酶切位点，经蛋白分析后，CP基因在表达载体中表达出来的融合蛋白大约43kD；P0基因在表达载体中表达出来的融合蛋白大约51 kD。

3 讨论

PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的寡核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性成功与否。设计PCR引物，首先要解决引物评估问题，即回答什么是合适的引物，以及这些引物的相互干扰是否在可接受的范围内。PCR引物设计问题中要考虑的生物参数分为两部分：首先是先确定单个引物的约束参数，据此可以区分引物的优劣；其次是根据不同PCR的要求确定引物间的约束参数，据此来评价引物之间的干扰是否在可接受的范围内。

表4 单条引物约束参数

3.1 普通PCR引物的约束参数

根据对文献的总结，对单个引物考虑了如下 11个约束条件 （表 4）： 引物长度（Abdelsalam.K.,2003 ）、Tm 值（SantaLucia.J.Jr.,1998）、引物 GC 含量（Dieffenbach.C.W.等，1993）、引物自身二聚体、二级发夹结构、寡核苷酸长度、3'端稳定性（Steven.Rozen，2007）、GC 夹（F.John.Burpo，2001）、3'端自互补、互补性、特异性（Lin.W.M.，1993）。

3.2 多重PCR的引物约束参数

在多重PCR反应中，引物的设计至关重要，是影响多重PCR反应成败的关键。在多重PCR反应中，单条引物的长度最好介于18～24 bp，引物太长，容易导致引物之间相互缠绕，严重影响多重PCR反应结果。同时，为了避免引物的非特异性扩增，引物必须高度特异。此外，要充分考虑到不同引物对之间互补的碱基序列，特别是引物间引物二聚体的形成，这将严重影响到引物的有效性。所有的引物对最好有相近的退火温度，引物的碱基构成最好是4种碱基的比例相当，G+C的含量最好介于40%～60%。如果可能的话，引物的序列以1～2个GC开头或结尾，避免3'端以A结尾。将引物设计好后，设计的引物序列应该与数据库中的核苷酸序列进行比对。如果扩增位点非常相似，存在着交叉反应，那么在引物的3'末端至少有1～2个特异性的碱基用于目的基因的特异性扩增。在多重PCR反应中，引物的浓度影响着多重PCR反应的结果。试验结果证明，太高的引物浓度或者太低的引物浓度在多重PCR的反应中都应该避免（Henegariu.O.，1997）。太高的引物浓度或许抑制了多重的反应结果，同时太低的引物浓度很可能是无效的。

根据（Peter.M.V，2004）对多个引物之间，以及引物对，考虑了如下7个约束条件（表5）：引物长度差、退火温度差、引物间3'端互补、产物长度、产物间长度差、引物间互补、特异性。

表5 用于多重PCR引物约束参数

3.3 实时定量PCR引物约束参数

对于实时定量PCR有两种类型：（1）染料法。一般用SYBRGreenⅠ染料较为常见，其引物设计参数根据（Moravec.T，2003），引物设计的基本原则是提高扩增的效率和检测特异性。一般遵循以下原则（表6）。（2）荧光探针检测法。要同时考虑引物和探针的质量。通常先满足普通PCR引物的设计要求，然后寻找合适的探针位置，再进行探针的设计，然后再将引物和探针之间进行比对分析（Kalender，2008）。用于实时定量PCR探针技术指标如表6。

表6 用于SYBR GreenⅠ染料法和探针法实时定量PCR引物约束参数

表7 带有酶切位点的引物约束参数

3.4 带有酶切位点的引物约束参数

对于带有酶切位点的引物设计，考虑了6个约束条件（表7）：酶切位点、目的序列、酶切位点的位置、酶切效率、引物长度、特异性。一般都是做基因克隆表达，除基本满足一般的引物要求外还有更高的要求。根据实验需要，确定需要扩增的DNA序列，并知道其CDS区序列（编码结构基因区，即从起始密码子区至终止密码子区）可登陆NCBI网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）查询。

3.5 影响引物设计成功率的因素

引物设计的优劣，是影响实验结果的重要因素。有些引物反应性能差，可以通过反应条件优化得到改善，但大多数情况改善的效果并不明显，因此，预先设计反应性能好的引物非常重要。针对引发PCR实验失败的三大主要因素（Andreson.R.，2008）：（1）引物和模板结合位点数目；（2）引物 GC 含量；（3）预期 PCR 扩增产物。引物设计的关键点主要有三：（1）特异性高：DNA模板上不存在与引物的错配部位或错配效率较低；（2）对引物解链温度Tm值的精确估算是确定PCR反应退火温度的前提条件，决定着实验的效率和精确性（Chavali.S，2005）。因此Tm值和GC含量在适当范围；引物利用效率高：引物内部和上、下游引物之间无互补序列；（3）引物的长度、扩增片段长度等参数也要加以考虑。

引物设计主要借助于生物软件，如：Primer3（Rozen.S.，2000）,Primerpremier （Singh.V.K，1998），0ligo（Rychlik.W,2007）等，但其重点在单引物的设计优化上，当中也有个别引物设计软件考虑到了引物之间设计优化，基于不同实验要求，引物设计中，由于实验的复杂性，几乎没有某一个引物设计软件能完美地完全满足要求。因此利用引物设计软件中不同技术指标参数。再加上人为的分析和选择因素不但可以大大提高引物设计的成功率，而且可以不必花费太多时间和精力。经实验总结可以归纳一下，主要有以下三点：第一，模板的因素。尽量避免选择一些困难模板，其中有一些模板本身的GC含量偏高或偏低，导致引物的GC含量不能控制在合适的范围。另外还有一些模板基因家族很大或者与其DNA序列相近的基因很多，导致引物的PCR扩增不特异。这些最终都造成PCR扩增的失败；第二，引物的筛选，运用Primer Premier 5.0设计了一组引物后，经过初次筛选得到几对适合要求的引物，还要在初次筛选的基础上进一步用Oligo6.0验证，然后筛选出能够进行特异高效PCR扩增的引物。

选出理论上较合适的引物以后，可以有以下两个步骤，保证引物设计的成功率：一是要将得到的一系列引物分别在Genebank中进行回检。也就是把每条引物在比对工具http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/的blast中进行同源性检索，弃掉与基因组其它部分同源性比较高的引物，也就是有可能形成错配的引物。一般连续10bp以上的同源有可能形成比较稳定的错配，特别是引物的3'端应避免连续5～6bp的同源。二是如果以mRNA为模板设计引物时还应注意：首先利用生物信息学的知识大致判断外显子与内含子的剪接位点 （例如http://CCR-081.mit.edu/GENESCAN.html的GENES-CAN工具或者GeneParser软件），然后弃掉正好位于剪接位点的引物，实验证明，按照上述原则设计合成的引物和探针，得到了高扩增效率和稳定的检测结果。

引物设计只是为PCR反应提供一种可能性，实验中由于影响PCR实验的因素较多，有时需要不断摸索条件，引物设计软件只是一种工具，只能为PCR实验设计提供比较可靠的引物，加速最佳条件的摸索，最终达到成功实现PCR实验的目的。

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